摘要：目的构建抑制多药耐药基因(MDR1)表达的RNAi腺病毒载体,探讨基因治疗改善癫痫多重耐药现象的可行性。方法根据大鼠MDR1基因序列,选择3个19nt的靶序列,设计并合成3对66nt含编码短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸,构建pSIREN-shuttle-MDR1重组质粒,测序分析正确后转染通过马桑内酯诱导的已表达多重耐药蛋白的大鼠星形胶质细胞,通过RT-PCR法测定多药耐药蛋白(P-gp)表达量,判断所设计的3条DNA序列对于P-gp表达的抑制作用。选择抑制效率最高的1个重组质粒,将其中的MDR1 shRNA表达结构酶切后插入腺病毒载体pAdeno-X,构建的pAdeno-MDR1经Pac1酶切后与脂质体共转染HEK293细胞进行病毒包装扩增纯化,所得病毒液作酶切电泳及测序分析正确后再转染大鼠星形胶质细胞模型。RT-PCR及免疫组织化学法分别测转染前后星形胶质细胞模型的MDR1及P-gp表达量。结果重组质粒及pAdeno-MDR1病毒经PCR、酶切、测序分析证实构建正确。病毒滴度为6×109pfu/mL。重组腺病毒转染星形胶质细胞后MDR1及P-gp表达量减少,干扰效率接近100%。结论成功构建针对大鼠MDR1基因的RNAi腺病毒载体,并通过体外实验证实其对大鼠MDR1基因的高效抑制作用。为进一步探索难治性癫痫的多药耐药机制和基因治疗奠定了基础。

摘要：目的建立简便、快速检测多药耐药基因(MDR1)C3435T与G2677T/A单核苷酸多态性(SNPs)的方法。方法针对MDR1C3435T分别设计相对的两对引物-聚合酶链反应(PCR-CTPP)、序列特异性聚合酶链反应(PCR-SSP)及DNA测序方法的引物,针对MDR1G2677T/A分别设计PCR-SSP和DNA测序方法的引物,优化PCR反应条件,将PCR-CTPP和PCR-SSP方法的基因分型结果与DNA测序结果进行比对,确定准确性。在优化条件下,分别对50例健康体检者的外周血白细胞DNA进行MDR1C3435T和G2677T/A基因型分析。结果通过条件优化,PCR-CTPP、PCR-SSP方法可快速的清晰区分MDR1C3435T与G2677T/A的基因型,结果与DNA测序方法相符合。50例健康体检个体MDR1C3435T与G2677T/A的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。MDR1 C3435T PCR-CTPP结合G2677T/APCR-SSP的检测方法为最佳选择。结论PCR-CTPP、PCR-SSP方法可简单、准确、经济、快速地检测MDR1C3435T、G2677T/ASNPs,具有临床应用价值。

摘要：目的　将简便可靠的非同位素原位杂交方法应用于老年急性白血病多药耐药基因 (mdr1 )的临床检测。方法　经光敏生物素标记的RNA探针 ,直接在细胞甩片上进行原位杂交 ,检测 40例老年急性白血病骨髓细胞 mdr1 m RNA。结果　杂交信号清晰 ,重现性好。难治复发病人中mdr1阳性率 77.2 7% ,初治病人 33.33% ,差异有显著性。结论　光敏生物素标记的 RNA探针原位杂交方法简便、快速、安全、可靠 ,可在临床用于老年急性白血病 mdr1常规检测 ,辅助临床治疗方案设计及判断预后。

摘要：目的建立定量检测多药耐药基因(MDR1)甲基化状态的方法。方法在MDR1基因启动子区含甲基化位点的-102～+186bp片段间设计1条正义引物和2条反义引物,采用不同的反义引物,经3次聚合酶链反应(PCR)获得较目的片段缺失30bp的竞争内标DNA片段,以Pbluescriptsk+为载体构建竞争内标DNA质粒;待检基因组DNA经甲基化敏感的限制性内切酶HpaⅡ消化后与竞争内标DNA竞争扩增MDR1基因;PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像分析仪扫描,目的片段量等于反应体系中竞争内标量乘以目的片段与竞争内标片段的光密度比值,HpaⅡ酶切与未经酶切标本所得目的片段量的比值为甲基化率。结果倍比稀释的基因组DNA与最佳量竞争内标共扩增MDR1基因启动子区目的片段,两扩增产物量的比值与基因组DNA量呈显著正相关,相关系数r=0.992,P<0.001。结论本方法用于MDR1基因甲基化定量检测,操作相对简单,定量准确可靠,适用于临床研究中大量样本检测。

摘要：目的构建靶向人多药耐药基因mdr1的microRNA(miRNA)干扰表达载体并进行鉴定。方法设计并合成4对编码mdr1 pre-miRNA的单链寡核苷酸,退火成双链后将其连接入miRNA干扰载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR,构建成重组质粒,酶切并测序鉴定其正确性。结果获得的重组质粒经酶切测序证实其插入片段大小与预期相符,序列完全正确。结论成功构建了4个靶向mdr1的miRNA干扰载体。

摘要：目的:建立多药耐药基因(mdr1)分型芯片,以检测患者的单核苷酸多态性(SNPs)。方法:设计并合成探针和引物,制备芯片;构建野生型和突变型质粒,以其为模板经PCR仪扩增后,与芯片上的探针杂交,并用扫描仪分析结果。结果:构建了野生型和突变型质粒,与芯片杂交能很好地区分基因型;优化了制备条件,建立了分型标准。结论:该基因芯片是一种快速特异的基因分型方法。

摘要：目的:设计与克隆特异切割多药耐药基因(MDR1) 的核酶。方法:针对人类MDR1 mRNA第Ⅶ外显子附近第196 密码子的GUC 序列,按照“锤头结构”模型,设计、合成核酶,并定向克隆入载体PGEM-3Zf(t) 中;通过PCR- SSCP法及限制性分析,确保扩增片断为外源插入的DNA序列,并经DNA测序证实。结果:重组质粒插入片断序列与设计序列一致。结论:设计、克隆核酶作用人类MDR1

摘要：目的高分辨熔解曲线技术(HRM)检测多药耐药基因(MDR1)外显子12单核苷酸多态性(SNP)。方法采用高分辨熔解技术对MDR1基因外显子12的SNP C1236T位点进行基因分型,以其-401C>T位点为例设计PCR扩增引物,按PCR扩增效率和熔解曲线进行退火温度、升温速度等条件的优化,并用此优化体系基因分型20例外周血标本,以测序验证。结果 20例标本经测序与检测结果一致。结论高分辨熔解曲线技术检测SNP是一种低成本、简便易行、常规化,高通量的基因分型方法,能用于大规模临床筛查。

摘要：目的建立多重逆转录和半巢式PCR的方法检测急性髓性白血病(AML)多药耐药(MDR)基因mRNA表达。方法分别设计针对5种MDR基因和1种内参照基因的特异性引物,采用多重逆转录和半巢式PCR检测耐药细胞株HL60/VCR和难治性AML患者骨髓标本中的MDR基因mRNA表达。结果应用此多重逆转录和半巢式PCR反应系统,可以特异的在一个反应管内同时检测到5种耐药基因。结论该方法对于检测AML患者MDR基因mRNA表达具有快速、灵敏、简便等特点,能快速同时分析大量样本,对MDR研究、诊断和治疗有一定应用前景。

摘要：目的探讨特异性靶向MDR1基因的siRNA逆转耐药型卵巢癌细胞株多药耐药的可行性。方法设计靶向于MDR1基因的3条siRNA,用脂质体转染试剂分别转染P-gp阳性表达的卵巢癌SKOV3/AR细胞,RT-PCR检测转染后48小时MDR1 mRNA的变化,流式细胞技术检测转染后72小时P-gp的表达情况;MTT法检测转染前及转染后48小时SKOV3/AR细胞对阿霉素、紫杉醇的敏感性。结果与空白对照组相比,含靶向MDR1基因的siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组的MDR1 mR-NA表达水平均有显著下降(P0.05)。siRNA-3干扰SKOV3/AR细胞后,阿霉素和紫杉醇的IC50分别下降为干扰前的1/3.56和1/3。结论 RNAi在体外实验能有效逆转卵巢癌细胞的耐药,为其在实体瘤耐药逆转的运用提供了实验依据,值得进一步研究。