摘要：目的 结合多酶恒温快速扩增技术（MIRA）和荧光探针法，建立一种快速检测日本血吸虫特异性基因片段的方法。方法 以日本血吸虫非长末端重复序列反转录转座子（SjR2）片段为靶序列，设计并合成3对引物和荧光探针，建立荧光MIRA法反应体系，PCR检测，绘制扩增曲线。比较并筛选扩增效果较好的引物对和探针浓度；通过检测1 fg/μl、5 fg/μl、10 fg/μl、100 fg/μl、1 pg/μl和10 pg/μl等不同浓度的日本血吸虫成虫基因组DNA，评价该法的灵敏度；提取卫氏并殖吸虫、华支睾吸虫、东方次睾吸虫、颚口线虫及刚地弓形虫基因组DNA，并用荧光MIRA法检测，评价其特异度。耳缘静脉采集兔血，分离血清，制备含1 fg、5 fg、10 fg、100 fg、1 pg和10 pg日本血吸虫成虫DNA的兔模拟阳性血清并进行DNA提取，以荧光MIRA法检测，评估该法检测血清中日本血吸虫靶基因的最低限度。结果 引物对1 (SjR2-1)的扩增效率较高，在反应第22个循环时（11 min）扩增出荧光产物，荧光值最高达170 000；探针量为0.6μl/反应时具有较好的荧光强度和低荧光背景。建立的荧光MIRA法在39℃时第26个循环（13 min）时扩增出荧光产物，检测血吸虫成虫DNA的最低检出限为1 fg/反应。扩增产物电泳显示，血吸虫基因组DNA模板含量为10 pg、1 pg、100 fg、10 fg时，均有电泳条带出现，电泳显示的检测限为10 fg/反应，产物大小为186 bp。仅含有日本血吸虫成虫DNA的反应管出现荧光扩增曲线，检测卫氏并殖吸虫、华支睾吸虫、东方次睾吸虫、颚口线虫及刚地弓形虫等基因组DNA未出现明显荧光扩增曲线。不同浓度的血吸虫DNA模拟阳性血清中，DNA含量为1 pg和10 pg时，有阳性扩增曲线出现，最快于第16个循环（8 min内）即出现阳性荧光扩增信号，该法检测模拟阳性血清中血吸虫成虫DNA的最低检测限为1 pg/反应。结论 成功建立了一种检测日本血吸虫特异性基因片段的荧光MIRA法，该法反应快速、敏感性高、特异性强，具有潜在的日本血吸虫病诊断应用价值。

摘要：目的:基于多酶恒温快速扩增(multienzyme isothermal rapid amplification,MIRA)与封闭式侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)联用技术,建立肉制品真实性快速检测方法,解决实验室方法不适于基层与现场快检需求的问题。方法:通过GenBank筛选猪、牛、羊、鸡、鸭线粒体基因的特异序列,使用DNAStar Megalign软件比对种内保守、种间特异的靶片段,依据MIRA引物探针设计原则设计靶基因引物探针组,通过阳性对照、阴性对照、空白对照等方式系统筛选引物探针,确定猪、牛、羊、鸡、鸭的专属性引物探针,并采用反应体系、反应温度、反应时间筛选,优化完善特异性检测方法。对方法进行系统的方法学考察,包括DNA提取、灵敏度、检出限、假阳性与假阴性考察等,验证方法的有效性。结果:使用建立的方法与实时荧光聚合酶链式反应检测进行比对分析,方法的平均假阳性率为3.49%、假阴性率为3.54%,符合现场快检方法的要求。结论:本研究建立了牛、羊、猪、鸡、鸭5种常见肉类的MIRA-LFD技术,并证实了其有效性和可行性,实现了肉制品真实性的现场快检。