摘要：目的利用多重荧光定量pcr技术，建立一种快速、准确、特异检测肠出血性大肠杆菌O157：H7的定量方法。方法选取肠出血性大肠杆菌O157：H7编码脂多糖基因（rfoE）和编码鞭毛抗原基因（fliC）作为检测的靶基因，设计引物和TaqMan—MGB探针，探针的5’端分别用FAM和HEX进行荧光标记，3’端标记MGB。优化pcr扩增体系，对多重实时荧光定量pcr方法的特异性、灵敏度、重复性评价，同时进行一定数量临床样本鉴定，与常规方法进行比较。结果本研究所建立的多重实时荧光定量pcr方法可准确、特异地检测和鉴定肠出血性大肠杆菌O157：H7，能够有效甄别肠出血性大肠杆菌O157：H7与非H7菌株，其他菌株均无阳性结果；该方法的灵敏度可达到10CFU／ml；定量检测的批间和批内变异系数均小于5％；对66例临床样本进行评价，结果显示15例肠出血性大肠杆菌O157：H7阳性，2例为肠出血性大肠杆菌O157：非H7阳性，其中16例与常规培养法结果符合，符合率达到98．49％。结论本研究建立的检测肠出血性大肠杆菌O157：H7多重实时荧光定量pcr方法快速，结果准确、可靠，操作简便，为肠出血性大肠杆菌O157：H7的临床诊断、现场流行病学调查和食品安全监测提供了新的鉴定方法。

摘要：为了建立可同时检测炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides)、白粉病病原菌(Erysiphe lonicera)和褐斑病病原菌(Cercospora rhamni)3种金银花重要叶部病原菌的多重实时荧光定量pcr快速检测方法,本试验基于3种病原菌ITS片段序列分别设计特异引物和TaqMan荧光探针,并制备重组质粒建立标准曲线;对建立的多重实时荧光定量pcr检测方法进行特异性、灵敏度、准确性验证。结果表明,本研究建立的多重实时荧光定量pcr快速检测方法仅针对金银花炭疽病、白粉病和褐斑病病原菌有特异性扩增;最低检测限为2.94×10^(2)copies/μL,比普通pcr法高100倍;利用本方法检测15份有叶部病害症状的金银花病叶,与DNA测序结果完全一致。综之,本研究建立的多重实时荧光pcr检测方法特异性强、灵敏度高,为金银花炭疽病、白粉病和褐斑病的早期诊断提供了技术支持。

摘要：根据欧洲型N基因、美洲型M基因和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)nsp2基因的各自保守序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和扩增条件,建立了能够检测欧洲型、美洲型和高致病性PRRSV的多重实时荧光定量pcr方法。该方法的重复试验表明其批内和批间的变异系数最高值分别为1.84%和1.76%;灵敏性试验表明其检测下限为10copies/μL;特异性试验表明与其他一些猪源病毒无交叉反应,具有良好的特异性;临床试验表明,该方法能够快速准确地检测出临床组织样本中美洲型及高致病性PRRSV的核酸;此外,本研究用欧洲型PRRSV质粒进一步验证了该方法可以检测出欧洲型PRRSV的目的基因。该方法的建立为不同类型的PRRSV快速检测提供了有效手段,可用于猪繁殖与呼吸综合征疫情的监测及防控。

摘要：目的:为提高COVID-19检测灵敏度,减少新冠患者临床假阴性检测结果,本研究建立了一种SARS-CoV-2低拷贝假病毒RNA捕获方法。方法:利用链霉亲和素磁珠,设计并合成生物素探针捕获SARS-CoV-2假病毒RNA;对磁珠用量、生物素探针浓度和洗脱次数等捕获条件进行了优化;参考WHO发布的序列,针对SARS-CoV-2病毒基因组的ORF1ab基因和N基因序列合成引物和TaqMan探针,对捕获的SARS-CoV-2假病毒RNA进行反转录实时荧光定量pcr检测。采用一步法和分步法检测、单重和多重实时荧光定量pcr检测,并分别比较检测结果。结果:本研究设计的生物素探针能富集到距离探针结合位点至少1.8 K处的序列,在生物素探针浓度12.5μM,磁珠的工作浓度333.33μg/mL时,合并RNA的两次洗脱液,对低拷贝病毒RNA的捕获效率最高。研究得到对低拷贝病毒RNA分步法比一步法、多重比单重实时荧光定量pcr检测更灵敏,进行分步法、多重实时荧光定量pcr检测限低于10 copies/μL,组间和重复实验组之间CT值变异系数均小于1%。所有阴性对照样品在检测中均为阴性。结论:本研究优化的链霉亲和素磁珠-生物素探针捕获法是富集SARS-CoV-2低拷贝假病毒RNA的有效方法,其抽提RNA病毒的结果优于一些商业化试剂盒,分步法、多重实时荧光定量pcr对SARS-CoV-2低拷贝假病毒RNA实现了高效检测,这为临床检测低拷贝RNA病毒提供了一种参考方案。

摘要：目的探讨多重实时荧光定量pcr(MRT-pcr)检测9种常见呼吸道病原体的临床应用价值。方法采用Primer Express3.0(ABI)和Primer3 Input 4.0设计引物和探针建立MRT-pcr法,通过构建质粒标准品分析该方法的最低检出限和特异性。并对204例临床标本中副流感病毒1、2、3型、肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒进行回顾性检测。结果 MRT-pcr法检测病原体的最低检出限达103copies/m L,特异性达100%,无交叉反应。204例咽拭子标本中,MRT-pcr检出呼吸道合胞病毒23例,副流感病毒1、2、3型13例,腺病毒15例,肺炎支原体15例,肺炎衣原体3例,甲型流感病毒13例与乙型流感病毒6例。该结果与其他试剂报告结果完全一致。结论多重实时荧光定量pcr具有快速、准确、特异性强等特点,在呼吸道病原体检测方面有重要价值。

摘要：目的建立一种基于多重实时荧光定量pcr(MRT-pcr)技术的可同时检测14种高危亚型人乳头瘤病毒(HPV16、18、31、33、35、39、52、45、51、56、58、59、66、68)癌基因E6/E7 mRNA的方法。方法对14种高危型HPV各自的E6/E7基因序列区域设计特异性引物和探针,配以优化的反应体系,形成HPV E6/E7 mRNA检测体系,评价方法检出限、特异性。收集223例临床样本,分别用自建的一步法MRT-pcr法与转录介导等温核酸扩增(TMA)技术(Aptima®HPV试剂盒)检测HPV E6/E7 mRNA,同时评估HPV E6/E7 mRNA检测结果与薄层液基细胞学检测、宫颈组织病理学检测结果的一致性。结果建立的检测方法对常见的低危型HPV无交叉检出,且对14种高危型HPV的检测限可达10~100 copies/μL。该方法检测223例临床标本的结果与Aptima®HPV检测结果相比,一致性较好(Kappa=0.910)。以组织病理结果为CINⅡ及以上的作为阳性,MRT-pcr法临床检测敏感性为84.0%,特异性为94.4%,阳性预测值为65.6%,阴性预测值为97.9%。结论建立的MRT-pcr方法具有特异性好、灵敏度高和稳定性好等优点,为HPV临床快速检测以及宫颈病变筛查提供了一个有效的技术平台。

摘要：目的建立一种基于TaqMan探针的多重实时荧光定量pcr(multiplex quantitative real-timepcr,multiplex qpcr)同时检测冷冻蔬菜中4种食源性致病菌的方法。方法针对金黄色葡萄球菌nuc基因、痢疾志贺菌rfc基因、沙门氏菌invA基因、单增李斯特氏菌hly基因,设计4对引物和探针,优化反应体系,建立稳定的多重qpcr反应体系。通过阳性菌株污染的方法验证体系的特异性,并确定了冷冻蔬菜样品在细菌水平的检出限。结果各对引物和探针对目标菌有较强的特异性,对其他非目标菌进行检测均未检出,人工污染冷冻蔬菜中志贺菌的检出限为10~2CFU/g,沙门氏菌和单增李斯特氏菌的检出限均为10~3 CFU/g,金黄色葡萄球菌的检出限为10~4 CFU/g。结论本研究可以实现冷冻蔬菜样品中4种致病菌qpcr高效检测。

摘要：目的设计检测多个靶基因的炭疽多重荧光定量pcr反应系统,建立快速准确的基因诊断方法,解决蜡样芽胞菌群基因诊断交叉反应问题。方法选择炭疽杆菌PX01毒素质粒基因pagA,PX02毒素质粒基因capB,以及染色体上的前噬菌体λBa03基因PL3作为靶基因,利用在线荧光定量pcr引物设计软件设计、优化多重pcr引物以及相应的TaqMan探针序列,对探针进行LNA标记并优化荧光pcr反应体系,构建多重实时荧光定量pcr反应系统。以3对引物pcr扩增并克隆靶基因的质粒标准品,倍比稀释后进行敏感度试验,以炭疽、蜡样芽胞杆菌、苏云金杆菌、蕈状杆菌以及常见肠道致病菌进行特异度试验,利用炭疽弱毒株污染土壤及奶粉进行模拟检测。结果 TaqMan-LNA多重实时荧光定量pcr可迅速检出3个炭疽杆菌靶基因,常用的探针法荧光定量pcr反应液均适用;pagA、CapB、PL3基因克隆标准品序列正确;该方法对pagA、CapB、PL3基因的检出限分别为63、398、114copies/μl,且仅检出炭疽杆菌基因,其余4种蜡样芽胞菌扩增均阴性。土壤及奶粉样品检测均阳性,其中pagA近检出限为6.6×104/ml,PL3基因检出限为6.6×105/ml。结论 TaqMan-LNA多重实时荧光定量pcr方法具有适用性广,检测迅速,灵敏度及特异度高等特点,能够将炭疽杆菌与蜡样芽胞菌群中其他细菌相鉴别,可试用于炭疽杆菌的感染检测。

摘要：为了建立一种能够同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和轮状病毒(RV)的多重实时荧光定量pcr方法,试验根据PEDV CV777株、TGEV Purdue P115株全基因序列和RV OSU毒株的VP6基因序列,设计出3对特异性引物及探针,优化反应条件,开展特异性、敏感性、重复性和验证试验。结果表明:该方法的检测最低限为1×10~2拷贝/μL的RNA标准品或1×10^(-2)TCID_(50)/mL的疫苗毒,具有较高的敏感性;变异系数均小于10%,符合统计学要求;利用本试验所建立的方法以及商品化试剂盒对20份临床样品进行检测,符合率为100%。说明本试验建立的方法特异性好,敏感性高,重复性稳定,可用于PEDV、TGEV和RV的鉴别诊断和防控。

摘要：目的建立对高致病性猪链球菌2型毒力基因SalK、virB4-89K、cps2J同步检测的多重实时荧光定量pcr检测方法。方法根据SalK、virB4-89K、cps2J基因保守区域设计并合成3对引物及其探针;通过反应体系和扩增条件优化,建立快速鉴定高致病性猪链球菌2型的方法,并对方法的特异性、敏感性、重复性指标进行评估。结果反应体系具有良好的扩增效率,全部扩增检测可在60min内完成。SalK、virB4-89K、cps2J基因检测灵敏度分别为19cfu/ml、27cfu/ml和32cfu/ml。重复性试验中变异系数均小于3%。用该方法考核33株猪链球菌,包括1/2型、1型、3型至33型,以及9株常见对照菌株,仅猪链球菌1/2型检测到cps2J基因荧光信号增强。对疫情现场获得的SS2感染者血液进行检测,3个基因均阳性。结论建立的多重实时荧光定量pcr方法可快速检测高致病性猪链球菌2型,并能鉴定是否含有89K毒力岛基因SalK、virB4-89K,具有敏感、特异、重复性好的特点。