摘要：【背景】布鲁氏菌(Brucella)、牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)和犬新孢子虫(Neospora caninum)是引起奶牛流产的重要病原,目前针对上述病原的血清学检测方法,存在特异性低或操作复杂等问题,pcr或RT-pcr方法仅能对单一病原进行检测;多重pcr可同时对多种病原进行检测,可极大地提高病原的检测效率。【目的】建立布鲁氏菌、牛传染性鼻气管炎病毒和犬新孢子虫的多重pcr检测方法,对临床样品进行快速检测。【方法】针对布鲁氏菌omp25基因、牛传染性鼻气管炎病毒gB基因和犬新孢子虫SRS2基因设计特异性引物,优化多重pcr的退火温度、引物浓度、延伸时间和循环次数;以沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、弓形虫(Toxoplasma gondii)和圆环病毒标准核酸验证多重pcr反应的特异性,以含靶基因的重组质粒验证多重pcr的敏感性;对55份流产奶牛阴道拭子进行检测。【结果】多重pcr的退火温度为59℃,延伸时间为40 s,循环次数为30,各引物浓度为1μmol/L;对omp25基因和SRS2基因的检测下限为4×10^(1) copies,对gB基因的检测下限为4×10^(2 )copies;与其他病原无交叉反应;55份样品中检出布鲁氏菌阳性9份,牛传染性鼻气管炎病毒阳性3份,犬新孢子虫阳性7份,其中布鲁氏菌和犬新孢子虫混合感染1份。【结论】成功构建了3种病原的多重pcr检测方法,能够对临床样品进行快速、准确的检测。

摘要：为建立一种能快速检测奶牛乳房炎主要病原菌(大肠埃希氏菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌)的多重pcr检测方法,根据大肠埃希氏菌phoA基因、无乳链球菌ef-tu基因、肺炎克雷伯氏菌Khe基因、金黄色葡萄球菌Nuc基因和肠炎沙门氏菌invA基因设计特异性引物,优化pcr反应体系与反应程序并进行特异性试验,同时分别构建含病原菌基因的pMD-19T重组质粒进行灵敏性试验。结果显示,多重pcr反应的最适引物工作浓度为0.8μmol/L,最适退火温度为59.6℃,最佳延伸时间为40 s,最合适的循环数为30次;优化后的多重pcr反应体系可扩增出5种目标病原菌的特异性条带;5种病原菌pcr检测灵敏度可达到5 copies/μL。进一步利用该多重pcr反应体系对采集的108份乳房炎乳样进行检测,检测结果显示,108份样本的阳性检出率为77.8%,大肠埃希氏菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和肠炎沙门氏菌的检出率分别为23.1%、8.3%、34.3%、8.3%、5.6%。结果表明,建立了一种具有良好特异性和灵敏性的多重pcr检测方法,在临床生产实践中可用于快速鉴定奶牛乳房炎的致病菌,为奶牛乳房炎的诊断、防控与流行病学调查提供了方法基础。

摘要：旨在建立一种快速鉴别检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)、基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)、鸭圆环病毒(DuCV)的多重pcr方法。参考GenBank中DTMUV E基因序列、DHAV-C VP1基因序列、DuCV Cap基因序列分别设计特异性检测引物,建立鉴别检测DTMUV、DHAV-C、DuCV的一步法多重pcr。该方法对DTMUV、DHAV-C、DuCV分别扩增出720、480和250 bp片段,对基因A型鸭甲肝病毒(DHAV-A)、新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)、鸭瘟病毒(DEV)、鸭细小病毒(DPV)、鸭呼肠孤病毒(MDRV)均无扩增产物;对DTMUV、DHAV-C、DuCV最低检测限度分别为3.8×10^(-5)、5.4×10^(-5)和6.2×10^(-5)μg/μL;与DTMUV、DHAV-C、DuCV单项pcr方法的符合率均为100%;该方法检测290份临床病料样品,DTMUV阳性率为8.97%,DHAV-C阳性率为10.69%,DuCV阳性率为2.07%,DTMUV/DuCV混合感染阳性率为4.14%,DHAV-C/DuCV混合感染阳性率为3.10%,DTMUV/DHAV-C/DuCV混合感染阳性率为0.34%。结论:成功建立了一种能同时鉴别检测DTMUV、DHAV-C、DuCV的一步法多重pcr,可用于临床中3种病毒单独感染或混合感染的鉴别检测和流行病学调查。

摘要：目的:建立一次性使用防疫用品中控制菌检测的多重pcr方法。方法:根据金黄色葡萄球菌Nuc、铜绿假单胞菌oprL、大肠埃希菌phoA、溶血性链球菌Mf、白色念珠菌SAP基因的保守序列设计引物,建立多重pcr反应体系,并验证其特异性、敏感性和重复性。结果:多重pcr扩增Nuc、oprL、phoA、Mf以及SAP基因的片段大小依次为486、305、666、808、265bp;检出限依次为2.3×10^(3)CFU/mL、2.0×10^(3)CFU/mL、1.1×10^(3)CFU/mL、7.0×10^(2)CFU/mL、4.1×10^(3)CFU/mL。结论:本研究建立的多重pcr检测方法能同时检测一次性防疫用品中的五种控制菌,方法灵敏、特异且重复性良好,能有效缩短检测周期,提高检验检测效率。

摘要：目的:建立1种快速检测鸡肉中布氏弓形菌、嗜低温弓形菌和斯氏弓形菌的多重pcr方法。方法:根据3种弓形菌的rpoB基因设计了4条引物,进行多重pcr扩增,测试pcr体系的特异性和灵敏度,并应用于鸡肉样品的检测。结果:对布氏弓形菌、嗜低温弓形菌和斯氏弓形菌的基因组DNA能够特异性扩增出373,149和236 bp大小的目的条带,检测灵敏度分别为1,10,10 pg。16份鸡肉样品中,7份样品被检出布氏弓形菌,3份样品被检出嗜低温弓形菌,1份样品被检出斯氏弓形菌,与常规分离培养法检测的符合率分别为100%,87.5%和100%。结论:建立的多重pcr法具有操作简便,检测周期短,特异性强和灵敏度高的特点,能够实现对鸡肉中布氏弓形菌、嗜低温弓形菌和斯氏弓形菌的同时快速检测和监控。

摘要：为建立多重pcr-液相芯片检测13个品系的转基因玉米的方法,针对BT11,BT176,Mon810,Mon863,T25,GA21,NK603,TC1507,Mon89034,Mir162,Mon88017,MIR604和BVLA430101这13种玉米品系的侧翼序列,设计合成了品系特异性引物/探针。在生物素标记的pcr扩增产物与固定在荧光编码微球上的品系特异探针杂交后,对微球进行流式检测。试验结果显示,13种转基因玉米的引物和探针具有较高的特异性,引物/探针相互之间无交叉扩增和非特异杂交,大部分转基因玉米品系的检测灵敏度达到0.1%水平,符合欧盟和其他国家有关转基因产品标识的要求。本方法的检测效率和准确性均高于传统方法,可作为进出口转基因产品和国内转基因检测的有效方法。

摘要：目的 对Xp11.2易位/TFE3基因不同融合类型设计多重pcr引物,证实多重pcr联合Sanger法测序的可行性,旨在探讨引物设计的重要性.方法 选取已通过高通量RNA-Seq测序证实TFE3融合类型的标本23例,其融合类型包括PSF-TFE3 3种,PRCC-TFE3 3种,ASPL-TFE3 2种, FUBP1-TFE3 1种,NONO-TFE3 2种,RBM10-TFE3 1种,MED15-TFE3 1种以及MATR3-TFE3 1种共计14种,对其用设计好的多重pcr引物进行pcr扩增并联合Sanger法测序进行验证,该次实验分4个多重pcr反应,包括14条不同基因的正向引物以及4条TFE3反向引物.结果 23例标本均与高通量RNA-Seq测序结果完全一致,可见所设计的引物通过多重pcr联合Sanger法测序是可行的.结论该方法的优势在于利用4个多重pcr反应便可确定是否存在上述14种TFE3融合类型阳性,并通过反向测序便可确定具体融合类型.因此从试剂成本方面考虑,尤其在大批量标本的TFE3融合类型筛查过程中,该方法较高通量RNA-Seq测序有很大的优势.

摘要：【目的】本研究旨在对广西地区母猪子宫内膜炎主要致病菌进行分离鉴定并建立一种病原菌多重pcr检测方法。根据病原菌分离鉴定结果,选取主要革兰氏阳性致病菌葡萄球菌(Sau)、链球菌(SS)、粪肠球菌(Efa)和革兰氏阴性致病菌大肠杆菌(Eco)、沙门氏菌(Sal)、肺炎克雷伯菌(Kpn)、奇异变形杆菌(Pmi)进行多重pcr检测方法的建立。【方法】提取3种革兰氏阳性菌株基因组并基于tuc、gdh、efs的保守区域设计3对特异性引物;提取4种革兰氏阴性菌株基因组并基于uid-A、SAL、ITS、ureR的保守区域设计4对特异性引物,进行引物特异性多重pcr验证同时对扩增条件中的退火温度、引物浓度优化,建立检测7种病原菌的多重pcr,完成样品检测评估。【结果】广西地区该猪场子宫内膜炎主要革兰氏阳性致病菌为葡萄球菌、链球菌、粪肠球菌,革兰氏阴性致病菌为大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌。建立多重pcr检测方法,退火温度在50℃时最佳。【结论】广西地区该猪场母猪子宫内膜炎的主要病原菌在本研究中成功地分离鉴定并建立多重pcr检测方法,为广西地区母猪子宫内膜炎的快速诊断和防控提供技术支持。

摘要：多重pcr技术广泛应用于多个研究领域,其中引物设计及扩增条件是提高多重pcr实验效率的关键因素.为探讨优化多重pcr实验的方法,以小鼠5个看家基因为研究对象,使用实验室新近开发的MPprimer程序设计多重pcr引物,并通过改变多种反应条件来优化多重pcr实验.结果表明,MPprimer程序能够设计出理想的多重pcr引物,并且通过对退火温度及延伸时间进行优化,可显著提高多重pcr实验效率,对于提高基因表达的规模化检测能力具有积极的促进作用.

摘要：海马是我国名贵动物药材之一,《中国药典》收载了5种海马的药用标准。随着海马资源储量的减少,市售海马基原增多,鉴别困难。该研究基于海马及其混伪品线粒体DNA序列差异设计了5对鉴别引物并构建同时鉴别三斑海马、克氏海马、管海马,刺海马和日本海马的多重pcr反应体系。pcr反应结束后进行凝胶电泳,管海马、日本海马、克氏海马、刺海马和三斑海马分别获得155, 222, 292, 352,458 bp的特异性鉴别条带,混伪品无条带。该研究建立的方法可以在单次pcr反应中准确鉴别所有药用海马的物种基原,为海马药材和饮片的质量控制提供了依据。