摘要：本试验以载牛乳铁蛋白肽-壳聚糖纳米粒(BLfcin-NPs)为添加剂,研究其对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)氧化损伤的保护作用。采用单因素完全随机试验设计,以BMECs为模型,采用不同浓度[0(对照组)、100、200、400、600、800、1000μmol/L]H_(2)O_(2)对BMECs分别处理0、2、4、6、8、12 h,确定构建BMECs氧化损伤模型的最佳H_(2)O_(2)浓度及作用时间。以500μg/mL的BLfcin-NPs预处理BMECs 12 h后用400μmol/L的H_(2)O_(2)处理6 h,检测BMECs内线粒体膜电位(MMP)、抗氧化指标以及抗氧化与凋亡相关基因mRNA相对表达量。结果显示:1)与0μmol/L H_(2)O_(2)处理的对照组相比,不同浓度H_(2)O_(2)作用6 h后显著或极显著降低BMECs活力(P<0.05),并对细胞产生毒性,并且在400μmol/L的H_(2)O_(2)作用下BMECs晚期凋亡率极显著升高(P<0.01)。400、600、800μmol/L的H_(2)O_(2)作用6 h后,BMECs内ROS含量增加,且呈剂量依赖性。2)与未进行BLfcin-NPs预处理的H_(2)O_(2)诱导的氧化损伤BMECs细胞相比,BLfcin-NPs预处理显著提高了BMECs内线粒体膜电位下降比例(P<0.05),显著升高了谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性(P<0.05),并显著降低了丙二醛(MDA)含量(P<0.05);此外,BLfcin-NPs预处理还显著上调了BMECs内抗氧化相关基因核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)和醌氧化还原酶1(NQO1)的mRNA相对表达量(P<0.05),同时显著上调了凋亡相关基因B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的mRNA相对表达量(P<0.05),并显著下调了Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的mRNA相对表达量(P<0.05)。综上所述,BLfcin-NPs通过调控Nrf2信号通路中关键基因的表达缓解H_(2)O_(2)诱导的BMECs氧化损伤。

摘要：本研究以奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)为模型,研究添加不同浓度精氨酸对BMECs酪蛋白合成的影响。采用单因素完全随机试验设计,以0.70 mmol/L精氨酸(DMEM培养基中精氨酸的浓度)为对照组,试验组精氨酸的浓度分别为1.40、2.80、5.60和11.20 mmol/L,每组6个重复。采用MTT法检测BMECs的增殖率;利用酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒检测BMECs中精氨酸代谢关键酶活性;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测BMECs中精氨酸代谢关键酶、酪蛋白以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路基因的相对表达量;运用蛋白质免疫印迹(Western Blot)技术检测酪蛋白表达量及mTOR信号通路蛋白磷酸化水平。结果表明:1)当精氨酸的浓度为2.80 mmol/L时,BMECs的增殖率显著高于对照组和其他精氨酸组(P<0.05);当精氨酸的浓度为2.80和5.60 mmol/L时,BMECs中鸟氨酸脱羧酶活性显著高于对照组和其他精氨酸组(P<0.05)。2) 2.80 mmol/L精氨酸组BMECs中αs1-酪蛋白、к-酪蛋白、蛋白激酶B、mTOR、核糖体p70s6激酶和真核翻译启始因子4E结合蛋白1的基因相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。3)1.40和2.80 mmol/L精氨酸组BMECs中αs1-酪蛋白表达量和S6K蛋白磷酸化水平显著高于对照组和其他精氨酸组(P<0.05)。4)2.80和5.60 mmol/L精氨酸组BMECs中mTOR信号通路蛋白磷酸化水平显著高于对照组和其他精氨酸组(P<0.05)。综合上述结果,当精氨酸的浓度为2.80 mmol/L时,对BMECs酪蛋白合成的促进效果最佳。

摘要：本试验旨在研究添加维生素A对一氧化氮(NO)诱导损伤的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳蛋白合成下降的缓解作用。试验采用单因子完全随机试验设计,以二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(DETA/NO)作为氧化应激源,将第3代BMECs随机分为9组,分别为对照组(CON组)、NO损伤组(NO组)和NO损伤+不同浓度(0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00μg/mL)维生素A预保护组(NA0.05、NA0.1、NA0.2、NA0.5、VA1、VA2和NA4组),每组4个重复。待细胞生长融合至80%~90%后,使用无血清培养基饥饿培养12 h后,CON组不添加维生素A和DETA/NO继续培养30 h;NO组不添加维生素A培养24 h后,再添加1000μmol/L的DETA/NO继续培养6 h;NA0.05、NA0.1、NA0.2、NA0.5、VA1、VA2和NA4组分别添加0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00μg/mL的维生素A培养24 h后,再添加1000μmol/L DETA/NO继续培养6 h。结果显示:与CON组相比,NO组细胞的相对增殖率以及细胞内硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、p70核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)活性与总抗氧化能力(T-AOC)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)含量以及αs1-酪蛋白(CSN1S1)、β-酪蛋白(CSN2)、κ-酪蛋白(CSN3)、mTOR、S6K1、真核起始因子4E(eIF4E)、真核起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)、信号转导和转录激活因子5(STAT5)的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),诱导型氧化氮合酶(iNOS)活性、活性氧(ROS)和NO含量显著升高(P<0.05)。与NO组相比,NA0.2~NA4组TrxR、CAT、GPx活性与T-AOC显著升高(P<0.05);NA0.2~NA1组CSN1S1的mRNA相对表达量显著上调(P<0.05);NA1组S6K1活性和GPx1、CSN2和酪氨酸激酶2(JAK2)的mRNA相对表达量显著上调(P<0.05),NO和ROS含量显著下降(P<0.05);NA4组mTOR、S6K1、4EBP1和eIF4E的mRNA相对表达量显著上调(P<0.05),iNOS活性显著下降(P<0.05);NA2、NA4组mTOR含量、TrxR和STAT5的mRNA相对表达量显著上调(P<0.05)。综上可知,NO诱导损伤BMECs后导致其细胞活力、抗氧化能力和乳蛋白合成相关酶活性及基因表达的下降;维生素A对NO诱导损伤的BMEC内乳蛋白合成下降有缓解作用,其效果以0.20~2.00μg/mL较好,尤以1.00μg/mL最好。

摘要：本试验旨在研究维生素A对一氧化氮(NO)诱导损伤的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂合成相关酶活性和基因表达下降的缓解作用,并从中筛选出适宜的维生素A添加量。本试验采用单因子完全随机试验设计,以二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(DETA/NO)作为氧化应激源,对照组不添加DETA/NO和维生素A培养30 h;试验1组(记为NO组)不添加维生素A培养24 h后添加DETA/NO继续培养6 h;试验2~8组(记为NOA0.05、NOA0.1、NOA0.2、NOA0.5、NOA1、NOA2和NOA4组)分别添加0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00和4.00μg/mL维生素A培养24 h后添加DETA/NO继续培养6 h。每组6个重复。结果表明:与对照组相比,NO组细胞活力,谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、脂肪酸合成酶(FASN)、脂蛋白脂酶(LPL)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)活性,甘油三酯(TG)含量,总抗氧化能力(T-AOC)及GPx、TrxR、过氧化酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)、ACC和FASN mRNA相对表达显著下降(P<0.05),活性氧(ROS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性和一氧化氮(NO)含量显著增加(P<0.05)。与NO组相比,NOA0.1~NOA4组细胞活力、T-AOC与ACC、FASN、LPL活性以及GPx1、TrxR、FASN、LPL、PPARγ和SREBP1 mRNA相对表达量显著增加(P<0.05);NOA0.2~NOA2组TG含量,TrxR、CAT、GPx和SCD活性及SCD mRNA相对表达量显著增加(P<0.05),而iNOS活性、NO含量显著降低(P<0.05)。综合上述结果分析得出,NO诱导BMECs损伤导致抗氧化功能及乳脂合成相关酶活性及基因表达、TG合成下降;维生素A缓解了NO诱导损伤的BMECs抗氧化功能和乳脂合成的下降,以0.20~2.00μg/mL的效果较好,尤以1.00μg/mL效果最好。

摘要：为探索bta-miR-29d-3p与奶牛乳腺上皮细胞乳脂代谢相关基因表达及甘油三酯含量之间的调控关系,试验设计并合成bta-miR-29d-3p的模拟物和抑制物,通过瞬时转染技术将bta-miR-29d-3p的模拟物和抑制物转染到奶牛乳腺上皮细胞中,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测bta-miR-29d-3p抑制或过表达后奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成相关基因表达水平的变化,细胞内甘油三酯含量用试剂盒检测。结果显示:bta-miR-29d-3p过表达后甘油三酯合成相关基因二酰甘油酰基转移酶(DGAT1)、线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM),脂肪酸合成相关基因乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)、脂肪酸合成酶(FASN),转录因子固醇调节元件结合蛋白1(SREBF1)的表达量显著降低(P<0.01),肝X受体Α(LXRA)表达量显著上升(P<0.01)。同时过表达bta-miR-29d-3p奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯含量显著降低(P<0.05)。干扰bta-miR-29d-3p显著增加了DGAT1、ACACA、FASN、GPAM、转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG1)(P<0.01)和SREBF1(P<0.05)的表达量,同时甘油三酯含量显著增加(P<0.05)。说明bta-miR-29d-3p通过改变乳脂代谢相关基因和甘油三酯水平,从而调节奶牛乳脂代谢。

摘要：本试验旨在探究白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)对二硝基氯苯(DNCB)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)氧化损伤的保护作用,并确定抑制白细胞介素-1(IL-1)活性的最佳IL-1Ra浓度。采用完全随机试验设计,将第3代BMEC随机分为12个组,每组6个重复。1组为对照组,利用不含DNCB及IL-1Ra的培养液培养6 h;2~6组是不同剂量的IL-1Ra处理组,分别利用含有1、5、10、20、50μg/L的IL-1Ra培养液培养6 h;7组为DNCB损伤组,利用含有300μmol/L的DNCB培养液培养6 h;8~12组是不同剂量的IL-1Ra保护组,分别利用含有1、5、10、20、50μg/L的IL-1Ra与300μmol/L DNCB培养液培养6 h。结果表明:与对照组相比,经300μmol/L的DNCB作用6 h后,BMEC的相对增殖率(RGR)以及含硒蛋白[硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)]、抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)]活性与总抗氧化能力(T-AOC)均显著降低(P0.05)。综上所述,IL-1Ra竞争性与IL-1R结合,抑制了IL-1的活性,进而抑制了DNCB引起的BMEC氧化损伤及炎症反应,本试验条件下以10μg/L为适宜浓度。

摘要：本试验旨在研究添加不同浓度葡萄糖对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖、葡萄糖摄取和酪蛋白合成相关基因表达的影响。将中国荷斯坦奶牛BMCEs纯化培养后,选取第2代细胞,采用单因子完全随机设计,设置4个组,分别向培养基中添加0(对照)、5、10、20 mmol/L葡萄糖,每组3个重复。结果表明:1)与对照组相比,添加葡萄糖能显著提高BMCEs相对增殖率(P<0.05)。2)与对照组相比,10 mmol/L组BMECs的葡萄糖相对摄取率显著提高(P<0.05)。3)与对照组相比,10~20 mmol/L组BMECs的葡萄糖转运载体1(GLUT1)、葡萄糖转运载体8(GLUT8)、葡萄糖转运载体(GLUT12)的基因表达量显著上调(P<0.05)。4)与对照组相比,10 mmol/L组αs1-酪蛋白(CSN1S1)、κ-酪蛋白(CSN3)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、真核翻译启始因子4E结合蛋白1(4EBP1)、真核翻译启始因子4E(eIF4E)和核糖体p70s6激酶(S6K1)的基因表达量显著上调(P<0.05)。综上,添加10~20 mmol/L葡萄糖能够促进BMECs对葡萄糖的摄取,上调酪蛋白合成相关基因的表达。

摘要：本试验旨在研究青蒿素对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)乳脂合成相关基因表达的影响。采用单因素完全随机试验设计,添加青蒿素浓度分别为0(对照)、10、20、40、60、80、100μmol/L的培养基与BMECs共培养1、3、6、9、12和24 h,每组6个重复。结果表明:与对照组相比,作用12 h后,青蒿素浓度为20、40、60μmol/L极显著提高了BMECs的相对活性(P<0.01),显著提高了脂质的聚集和细胞内甘油三酯(TG)的含量(P<0.05);实时荧光定量PCR结果表明,青蒿素能显著提高乳脂合成相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、胆固醇调节元件结合蛋白1-c(SREBP1-c)、脂肪酸合成酶(FASN)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)基因相对表达量(P<0.05);青蒿素也可极显著提高丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)基因相对表达量(P<0.01);Western-blot结果表明,40μmol/L的青蒿素显著上调了腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、mTOR、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、PPARγ、SREBP1-c蛋白的表达(P<0.05)。综上所述,40μmol/L的青蒿素提高BMECs乳脂合成的效果较好,青蒿素通过调控AMPK-mTOR信号通路中关键基因的转录从而促进BMECs中乳脂肪的合成。

摘要：本试验采用体外法研究壳聚糖(CTS)对无乳链球菌(***)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)炎性损伤的保护作用。首先,采用不同浓度(0、15.625、31.25、62.5、125、250、500和1000 mg/mL)的CTS处理BMECs 12和24 h后,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测BMECs活性,根据BMECs活性筛选出CTS的适宜作用时间(24 h)和作用浓度(31.25、125和250 mg/mL),用于后续试验。然后,采用双因素试验设计,以不进行CTS处理和***诱导的BMECs作为对照组,以***诱导6 h的BMECs作为***组,以不同浓度(31.25、125和250 mg/mL)CTS处理24 h的BMECs作为CTS组,以不同浓度(31.25、125和250 mg/mL)CTS处理24 h后再经***诱导6 h的BMECs作为CTS(-)+sgc组,每组4个重复。使用荧光定量PCR的方法检测各组BMECs的白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-8、Toll样受体2(TLR2)、髓样分化因子88(MyD88)、白细胞介素-1受体相关激酶4(IRAK 4)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)和转化生长因子β活化激酶1(TAK1)的mRNA表达量,使用Western blot的方法检测各组BMECs的核因子-κB(NF-κB)抑制蛋白-α(IκB-α)、磷酸化NF-κB-p65(p-NF-κB-p65)、磷酸化p38(p-p38)、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)和磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)的蛋白表达量。结果显示:1)31.25和125 mg/mL的CTS显著或极显著降低了BMECs的IL-6、IL-8、TLR2、MyD88、IRAK4和TRAF6 mRNA表达量(P<0.05或P<0.01);31.25、125和250 mg/mL的CTS极显著降低了***诱导的BMECs的IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-8、TLR2、MyD88、IRAK4、TRAF6和TAK1 mRNA表达量(P<0.01)。2)31.25、125和250 mg/mL的CTS显著或极显著降低了BMECs和***诱导的BMECs的p-NF-κB-p65、p-p38、p-ERK1/2和p-JNK蛋白表达量(P<0.05或P<0.01)。由上述结果可知,CTS可以通过抑制NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路转导来降低***诱导BMECs产生炎症反应,从而有效保护细胞,降低炎性损伤作用。

摘要：本试验旨在研究维生素A对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂合成的影响。试验采用单因子完全随机试验设计,将第3代BMECs随机分为9个组,每组6个重复。其中,对照组(CON组)用生长培养基培养30 h;H_(2)O_(2)损伤组(H_(2)O_(2)组)用CON组培养基培养24 h后,再加入H_(2)O_(2)继续培养6 h;7个维生素A预保护组则在CON组培养基中添加不同浓度维生素A培养24 h后,再加入H_(2)O_(2)继续培养6 h,维生素A浓度分别为0.05(0.05 VAH组)、0.10(0.1VAH组)、0.20(0.2VAH组)、0.50(0.5VAH组)、1.00(1VAH组)、2.00(2VAH组)和4.00μg/mL(4VAH组)。结果显示:与CON组相比,H_(2)O_(2)组诱导BMECs发生氧化损伤,BMECs的相对增殖率(RGR)、甘油三酯(TG)含量、总抗氧化能力(T-AOC)以及总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、硫氧还蛋白还原酶1(TrxR1)、脂肪酸合成酶(FASN)、脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)、脂蛋白酯酶(LPL)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)活性显著降低(P≤0.05),ACC、FASN、谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)、TrxR1、过氧化酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)相对表达量显著降低(P≤0.05),但活性氧(ROS)活性显著提高(P≤0.05)。与H_(2)O_(2)组相比,0.2VAH~2VAH组BMECs的RGR和GPx1、GPx4、TrxR1、LPL、SCD、FASN、PPARγ和SREBP1相对表达量以及GPx活性和T-AOC显著提高(P≤0.05),并且1VAH组的TG含量、T-SOD和CAT活性显著提高(P≤0.05),且1VAH组的ROS活性显著降低(P≤0.05)。由此可见,维生素A对由H_(2)O_(2)诱导引起的BMECs内抗氧化能力下降、乳脂从头合成和脂肪酸摄取相关酶活性及其基因表达的下调具有剂量依赖性的减缓效果,以0.20~2.00μg/mL维生素A的效果较好,尤以1.00μg/mL维生素A的效果最好。