摘要：背景:半乳凝素1表达于室管膜下区的星形胶质细胞中并诱导其分化,分化的星形胶质细胞可明显提高脑源性神经生长因子的产生。目的:观察半乳凝素1诱导脑损伤大鼠内源性神经干细胞的原位增殖和定向分化效果。设计、时间及地点:细胞学体内观察实验,于2007-03/11在佳木斯大学神经科学研究所完成。材料:纯种清洁级成年Wistar大鼠48只,随机分为模型组、药物组,24只/组。半乳凝素1为北京晶美生物工程公司产品。方法:两组大鼠均采用线栓法制作局灶性大脑中动脉闭塞模型。造模后24h,药物组经右侧侧脑室注入10μL浓度为0.2g/L的半乳凝素1,模型组注射等量生理盐水。分别于缺血再灌注后3,7,14,28d处死大鼠,取脑组织制作石蜡切片,处死前1d腹腔注射Brdu。主要观察指标:免疫组织化学染色检测海马齿状回颗粒细胞层下区Brdu和巢蛋白阳性细胞的表达,免疫荧光双标法检测海马齿状回颗粒细胞层下区胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达。结果:模型组脑缺血后3dBrdu、巢蛋白阳性细胞开始增加,7d增殖达高峰,14d后表达开始下降,28d后下降至最低。药物组脑缺血后3d两种阳性细胞均明显增加;7d增殖达高峰,半定量分析Brdu、巢蛋白阳性细胞数分别是模型组的1.8倍和2倍;14d后开始下降;28d降至最低,但仍明显多于模型组(P0.05);药物组脑缺血7dBrdu+/神经元特异性烯醇化酶+细胞开始大量增多,28d达高峰,半定量分析所有BrdU+细胞中约27%表达神经元特异性烯醇化酶,明显高于模型组(P<0.05)。结论:半乳凝素1在大鼠脑缺血后可激活内源性神经干细胞的原位增殖及分化,且分化后表达成熟神经元标志物神经元特异性烯醇化酶阳性细胞明显增多。

摘要：背景:在胚胎干细胞向肝细胞诱导分化的培养条件基础上增加向胆管上皮细胞分化的培养条件,使其向胆管上皮细胞方向分化在理论上是可行的。目的:验证在细胞生长因子胚胎干细胞体外定向分化为胆管上皮细胞的可行性。设计:单一样本观察。单位:中山大学附属第一医院。材料:选用BALB/c系小鼠胚胎干细胞(BALB/c-ES)由中山大学实验动物中心建系和保存。分化生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、上皮生长因子、角化细胞生长因子均为美国Sigma公司产品,实验用抗小鼠细胞角蛋白7(CK7)和细胞角蛋白19(CK19)购自丹麦DAKO公司,间接免疫荧光试剂盒为美国Biodesign产品,IX70-S8F2倒置相差荧光显微镜为日本OLYMPUS产品。方法:实验于2004-10/2005-06在中山大学附属第一医院中心实验室完成。①将小鼠胚胎干细胞进行拟胚体分化,在培养系统中按不同时间段分别添加分化生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、上皮生长因子、角化细胞生长因子,使胚胎干细胞向胆管上皮细胞方向分化。以培养液中不添加上述细胞生长因子为对照组,使胚胎干细胞自然分化。②采用倒置相差荧光显微镜动态观察细胞生长及三维的环状结构形成情况。③于细胞分化第10天开始采用免疫细胞化学方法检测胆管上皮细胞标记物CK7、CK19,γ-谷胺酰转肽酶(GGT)表达变化,同时观察γ-谷胺酰转肽酶阳性细胞的形态学特点。主要观察指标:①细胞生长及三维环状结构形成情况。②胆管上皮细胞标记蛋白CK7、CK19的表达。③胆管上皮细胞标记酶GGT表达及其阳性细胞形态学情况。结果:①细胞生长及三维的环状结构形成情况:胚胎干细胞悬浮培养10h后即可见小的拟胚体形成并悬浮在培养液中。分化第10天在拟胚体细胞分化群落中出现一种三维的环状结构,细胞呈同心圆层状排列,内层细胞排列紧密,继续培养,内层细胞逐渐排列疏松,分化20d左右时细胞活力达到最好,其后活力开始下降,分化36d时三维结构裂解并呈条索状悬浮于培养液中。对照组环状结构于第13天出现,细胞结构于27d裂解。②CK7,CK19表达:胆管上皮细胞环状结构形成当日即有CK7表达,分化第13天时CK19表达,其后两者同时表达于三维结构细胞中并随培养时间增加而表达逐渐增强。对照组细胞在分化第13,15天开始出现CK7,CK19表达。③胆管上皮细胞标记酶GGT表达及其阳性细胞形态学变化:加入生长因子后,细胞环状结构形成初始即表达GGT,说明此结构中含有胆管上皮细胞。在环状结构形成初始,细胞间连接紧密,不能分清单个细胞结构,随着培养时间增长,单细胞结构逐渐清晰。GGT阳性细胞呈多角型或方形排列,核位于中央,细胞器较少,胞质染色较浅,符合立方上皮细胞特点,体现出胆管上皮细胞的形态学特点。结论:胚胎干细胞在细胞生长因子的作用下可定向分化为胆管上皮细胞并可以形成类胆管样结构。

摘要：脂筏是膜脂双层内含有特殊脂质及蛋白质的一种液态有序相微区，是膜内外信号交流的扳机点，80％的药物靶点设计是针对其结构中受体或通道蛋白，它的功能状态与肿瘤、动脉粥样硬化、HIV等多种疾病以及病毒感染的分子机制有关。2010年science发表了题为“脂筏-细胞膜的主导结构”综述中，作者认为由鞘酯、胆同醇、蛋白质分子自组装而形成了动态有序的纳米级脂筏，

摘要：目的:研究开发一种简易、快速在体外使多能诱导干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)定向分化为功能性肝样细胞的培养方法。方法:根据正常肝细胞在体内的发育规律,设计简化诱导方法使i PS细胞定向分化为内胚层细胞,应用qPCR和流式细胞术鉴定其纯度后进一步诱导分化为肝样细胞,并通过qPCR、ELISA、免疫荧光等技术鉴定肝细胞的性状和功能。结果:i PS细胞诱导7天后,OCT4和NANOG的表达水平显著下降,内胚层细胞相关基因CXCR4、FOXA2和HNF4A表达水平明显升高。内胚层细胞继续诱导培养15天后,肝细胞特异性标志基因ALB、TDO2、RBP4、G6PC和肝药酶基因CYPs等显著上调,同时产生高水平的白蛋白和尿素;PAS糖原染色为阳性,能主动摄取和释放吲哚菁绿,证实诱导成的肝样细胞具备正常肝细胞的部分功能。结论:该诱导方案能够在体外使i PS细胞遵循正常肝脏发育通路简易、高效地分化为功能性肝细胞。本研究为大量获得iPS来源的肝细胞及其在细胞疗法和药筛模型中的运用提供了可能性。

摘要：【目的】观察低浓度马血清体外诱导成肌细胞C2C12向成熟肌细胞分化、形成肌管的作用,探索定向诱导肌分化的途径及其分子机制。【方法】将C2C12成肌细胞用含不同浓度马血清的高糖DMEM培养基培养,收集细胞,在相差显微镜下观察形态变化,并通过免疫细胞化学(Imminocytochemistry,ICC)及RT-PCR方法分别检测肌性相关基因表达的改变。【结果】①20mL/L和50mL/L的马血清均能促使C2C12细胞形成肌小管,20mL/L浓度马血清诱导效率最好(第7天时肌小管形成率分别为31.4%±2.1%和19.0%±1.6%,P<0.001)。②20mL/L马血清诱导3～4d开始有肌管形成,之后肌管越来越多,到8～9d达高峰(第9天40.2%±1.3%),往后细胞逐渐衰老死亡。③20mL/L马血清诱导C2C12细胞向成熟肌细胞分化过程中,肌相关蛋白分子表达发生变化:结蛋白(desmin)、成肌分化抗原(MyoD)、生肌素(myogenin)和肌球蛋白(myosin)等表达逐渐增强(未刺激时分别约为49.6%±1.1%、23.4%±1.1%、4.8%±1.6%和2.6%±1.5%;第6天时分别提高为80.4%±1.8%、85.4%±1.1%、22.2%±1.1%和26.0%±1.6%;P<0.001);desmin、MyoD和myogenin相应的mRNA分子也可以通过RT-PCR检测到。【结论】①低浓度的马血清能够有效刺激C2C12成肌细胞向成熟细胞分化,以20mL/L浓度效果最好;②C2C12细胞是研究肌细胞发育分化的理想模板;③肌分化发育过程比较复杂,许多因素都可能起影响,研究设计要尽量标准化。

摘要：背景：骨髓内的间充质干细胞含量极少，因此课题立项设计之一即如伺得到足够数量的骨髓间充质干细胞，并避免细胞培养过程中因动物血清造成的病原体污染和异种血清所致的过敏反应。目的：拟建立脐带血血清培养系统，以实现体外扩增人骨髓间充质干细胞的目标。设计、时间及地点：开放性实验，于2006-09／2007-10在中南大学湘雅二医院细胞生物实验室完成。材料：12份骨髓标本由中南大学湘雅二医院和湖南省湘潭市中心医院提供，6例采自正常供者，6例采自拟行造血干细胞移植的肿瘤患者。方法：无菌条件下抽取未抗凝的脐带血，静置待血凝块完全析出后吸取血清，离心弃沉淀，取各项病原微生物检测均呈阴性的脐带血血清用于细胞培养，临用前56℃水浴灭活30min。抽取正常供者和肿瘤患者的骨髓液100mL／份，采用Ficoll Paque分离液分离骨髓单个核细胞，加入含体积分数为0．1脐带血血清的DMEM／F12进行传代培养。传至第3代低温、液氮冻存，4-8周后予以解冻复苏，胰蛋白酶消化传代。取第4代骨髓间充质干细胞，锥虫蓝染色后，N／k成骨诱导体系培养14d，碱性磷酸酶染色；加入脂肪诱导体系培养14d，油红O染色。主要观察指标：绘制细胞生长曲线，流式细胞仪测定细胞周期及表面抗原的表达，骨髓间充质干细胞定向分化情况。结果：骨髓间充质干细胞扩增培养至第4代，接种后两三天为生长潜伏期，3-5d为对数增殖期，5-7d细胞生长缓慢进入平台期。采自正常供者和肿瘤患者的骨髓间充质干细胞，冻存前后扩增数量均基本相似（P〉0．05），细胞存活率均〉96％，CD29、CD73、CD105阳性率均〉90％，CD31、CD34、CD45阳性率均〈5％，诱导2周后成骨细胞和脂肪细胞的阳性率均〉85％。结论：应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人骨髓间充质干细胞，且冻存前后骨髓间充质干细胞生物学特性没有明显改变。

摘要：背景:为避免骨髓间充质干细胞培养过程中应用异种血清的排斥以及提高骨髓间充质干细胞培养效率,制备脐带血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞是目前的研究热点。目的:比较脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性。设计、时间及地点:开放性实验,于2006-10/2008-06在中南大学湘雅二医院细胞生物实验室完成。材料:16份骨髓标本由中南大学湘雅二医院和湖南省湘潭市中心医院提供。方法:采用FicollPaque细胞分离液从16例新鲜成人骨髓穿刺液中分离骨髓间充质干细胞,分别用含体积分数为10%脐带血清、成人自体血清的DMEM/F12培养基培养,取第4代细胞进行实验。流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系分别诱导各组骨髓间充质干细胞定向分化,通过细胞形态观察、免疫表型及免疫化学染色进行鉴定。主要观察指标:①细胞形态。②骨髓间充质干细胞计数和细胞周期。③表面标志物的鉴定。④免疫组织化学染色观察骨髓间充质干细胞诱导成骨、成脂情况。结果:①脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞在增殖数量和速度上优于成人自体血清组(P<0.05)。两种血清培养条件下,只有少数细胞处于活跃的增殖期,脐带血清组S期细胞多于成人自体血清组(P<0.05)。②脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞表达CD29、CD73、CD105的阳性率均在90%以上,高于成人自体血清组(P<0.05);而CD31、CD34、CD45的阳性率均在2%以下,CD31阳性率低于成人自体血清组(P<0.05)。③脐带血清培养的骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞阳性率和脂肪细胞阳性率均高于自体血清组(P<0.05)。结论:脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞的纯度和体外诱导分化能力比成人自体血清组高,更适合临床应用。