摘要：利用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-fqPCR)技术对益生菌粉中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)进行快速精准鉴定。选取植物乳杆菌的16S rRNA基因,利用Primer Express 3.0.1设计引物探针,验证引物探针的特异性、灵敏度和抗干扰性,建立植物乳杆菌的RT-fqPCR检测方法。益生菌粉中菌株未经过平板培养分离,直接对样品进行脱氧核糖核酸(DNA)提取,利用RT-fqPCR技术对植物乳杆菌进行快速精准鉴定。结果表明,所设计的引物探针可以有效的扩增植物乳杆菌,具有良好的特异性;灵敏度在DNA水平可以达到1 pg/μL,并且具有很好的抗干扰性,对12种益生菌粉样品直接提取的DNA进行RT-fqPCR快速鉴定,其中有10种益生菌样品粉检测出植物乳杆菌。

摘要：本实验通过设计特异引物序列,对经低温诱导处理的球等鞭金藻3011的脂肪酸去饱和酶基因片段进行筛选,以实时荧光定量聚合酶链式反应检测酶的表达量,探索低温对该多不饱和脂肪酸脱饱和酶基因表达量的影响。结果表明:用prime5设计包括内参基因在内的14条引物,其中7条引物具有特异性扩增,根据扩增效果对其扩增体系进行优化。结果表明:Des4、Des5、Des6、Des8、Des9和Des12 m RNA相对最大表达量分别为7.71、11.33、42.58、22.02、73.91和16.01。随温度的降低均呈现先增加后降低的趋势。根据SPSS 19.0统计分析,6个基因在其m RNA相对表达量最大的诱导时间时,18℃的m RNA相对表达量与其在12、15、21℃3个温度条件下的相对表达量相比具有极显著差异(P<0.01)。18℃条件下诱导24 h可以有效增加Des9基因在球等鞭金藻3011中的表达。此研究结果为人为调控微藻的多不饱和脂肪酸含量提供了一条可行的方法。

摘要：目的：建立一个含扩增内对照（IAC）的三重TaqMan real-time PCR体系，以检测霍乱毒素基因ctxA和肠产毒性大肠埃希菌的不耐热肠毒素基因elt。方法针对ctxA、elt和IAC设计引物和探针，进行灵敏性和特异性分析，评价三重反应之间的互相影响。结果该检测体系灵敏度为ctxA每个反应94拷贝，elt每个反应79拷贝，扩增效率分别为94.7%与98.1%。ctxA与elt拷贝数比例为1∶1～1∶10时，二者均能良好扩增；elt或ctxA的量是IAC的100倍以上时，IAC扩增受到抑制。结论该检测体系具有良好的灵敏性和特异性，可以用于腹泻粪便中感染病原菌的检测，其中内对照检测可以提示粪便样本中是否存在PCR抑制因子。

摘要：目的：建立利用实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌浓度的方法，为检测人肠道内菌群浓度提供有效手段。方法：提取60例儿童粪便样本中细菌总DNA。选择细菌种属的特异性基因16SrRNA作为扩增区，依据双歧杆菌的16 SrRNA序列共设计3条引物，以常规 PCR扩增出的16 SrRNA部分基因片段制作标准品，应用 SYBR Green Ⅰ双链嵌合染料，对连续稀释的标准品及待测样本进行分析，建立绝对定量的标准曲线，同时计算出待测样本双歧杆菌浓度；根据可检测到的标准品最低拷贝数计算反应灵敏度；分析 PCR产物熔解曲线评价反应特异性；重复检测梯度稀释的标准品，用相同浓度标准品的Ct值变异系数（CV）评价反应稳定性。结果：常规PCR扩增出双歧杆菌16SrRNA部分基因片段长度约为613 bp，测序结果正确，成功构建了双歧杆菌实时荧光定量PCR反应中的标准品；生成的标准曲线R2＝0.999，最低检测限度为每个反应1.48＆#215;102个拷贝；实时荧光定量PCR产物的熔解曲线为单峰。对待测样本分批进行荧光定量 PCR检测，各组间每微升1.48×10^3～1.48×10^7个拷贝浓度标准品Ct值的变异系数为2.94％、3.39％、3.54％、3.08％和3.34％。60份儿童粪便样本双歧杆菌浓度对数值为7.77±0.86（拷贝数·-1湿便）。结论：本研究所建立的实时荧光定量 PCR法敏感性高、特异性强，且重复性好，适用于检测人粪便中双歧杆菌的浓度。

摘要：目的建立多房棘球蚴（泡球蚴）感染小鼠肝脏丝氨酸蛋白酶抑制基因（Serpina3g）实时荧光定量PCR（RT—qPCR）的检测方法及与常规RT—PCR检测方法的比较。方法肉眼直视下肝脏穿刺注射100μl泡球蚴组织匀浆液建立泡球蚴感染小鼠模型，3个月后将小鼠处死，Trizol法提取肝脏总RNA，反转录获得cDNA。依据Serpina3g的编码基因（NM_009251）保守序列，通过Primer5软件设计定量引物，以β—actin作为内参。以健康小鼠肝脏获得的cDNA依次10倍梯度稀释制备标准品（1×10^2～1×10^6pg），利用SYBR Green RT-qPCR方法检测Serpina3g基因，然后根据cDNA浓度与循环值（Ct）的线性关系，绘制标准曲线，确定RT—qPCR检测的最佳条件和重复性；并将RT—qPCR结果与常规RT—PCR琼脂糖凝胶电泳结果进行特异性、灵敏度和定量等方面的比较。结果筛选出Serpina3g基因定量引物，最佳退火温度为56．g℃；RT—qPCR无非特异性扩增，标准品及样品熔解温度均在80．5℃，熔解峰单一；标准曲线斜率为-2．833（效率），相关系数r=0．996：5个不同梯度的样本（1×10^2～1×10^6pg）重复检测5次均为阳性，变异〈5％；mRNA检出限为1×10^2pg，总RNA在1×10^2-1×10^6pg内均可以进行扩增；常规RT-PCR方法mRNA检出限仅为1×10^6pg。结论成功建立了小鼠源Serpina3g的RT—qPCR检测方法，在特异性、灵敏度、重复性和定量方面优于常规RT—PCR。

摘要：目的:根皮苷-2-O-糖基转移酶(phloridzin 2’-O-glycosyltransferase,P2’-GT)是根皮苷合成最后一步关键酶,可以把根皮素转化成根皮苷,本研究在富士苹果中克隆出P2’-GT基因,对基因编码产物进行生物信息学分析和基因的表达模式分析。方法:以苹果皮为材料,提取RNA反转录合成cDNA为模板,设计特异性引物进行扩增和测序,利用Pro Param tool、TMHMM等在线软件对编码蛋白进行生物信息学分析,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(realtime?uorescence quatitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)分析P2’-GT在苹果不同部位、不同苹果品种和不同生长时期的表达差异。结果:P2’-GT cDNA全长1 452 bp,编码483个氨基酸,相对分子质量53.6 kDa,等电点5.76,该基因编码蛋白是不稳定蛋白,不具有明显的跨膜结构,二级结构主要有α-螺旋、无规卷曲和延伸链组成,三级结构结果显示P2’-GT蛋白模型与对苯二酚葡萄糖基转移酶相似度最高(41.32%),进化分析表明P2’-GT与白梨糖基转移酶同源性最高。RTFQ-PCR分析发现P2’-GT在3种苹果皮中均高效表达,在叶和根中微量表达,在果肉中不表达;P2’-GT的转录表达受苹果发育调控,在生长初期几乎不表达,随着苹果发育表达量逐渐增加,在生长中期达到最高值,随后开始减少,至苹果成熟期下降到最高值的50%水平。此外,P2’-GT在3种苹果品种中表达不同,在澳洲青苹中表达量最高,在嘎啦中表达量最低。结论:本研究明确了P2’-GT的生物信息学特性及P2’-GT基因在不同生长期和不同部位的表达差异,为调控根皮苷合成的研究提供理论依据。

摘要：根据GenBank中登录的隐孢子虫小亚基rRNA基因序列设计1对引物,并以标准基因组DNA为模板,初步建立了检测乳牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫的SYBR Green real time PCR方法,并对乳牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫阳性样品和上海40份乳牛粪便进行了检测。结果表明,此次建立的real timePCR对微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫均能扩增出曲线,且其他寄生虫(鸡贝氏隐孢子虫、刚地弓形虫、犬新孢子虫)和大肠杆菌均未检测到;标准基因组DNA的检测阈值达到5个拷贝,牛粪中卵囊的最低检测量为每克粪便5个卵囊,乳牛粪便阳性率为15%(6/40)。表明,建立的荧光定量PCR快速、特异、敏感,可用于乳牛隐孢子虫病的流行病学调查。

摘要：芝麻是重要的食品过敏原之一,微小剂量即可引起严重的过敏反应。针对芝麻过敏蛋白-2S白蛋白的基因序列设计PCR扩增引物,建立并优化芝麻过敏原检测的普通聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)方法。结果表明,两种方法的最低检测限分别为0.1,0.01ng DNA,该方法特异性良好,成本较低,具有一定的应用价值。

摘要：采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)分析不同剂量酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptide,CGMP)对小鼠肠道双歧杆菌增殖水平的影响,揭示乳源CGMP是否有增殖肠道关键益生菌的功能。选用50只健康BALB/c小鼠,随机分为对照组,安慰组(灌胃生理盐水0.2 m L),乳源CGMP低、中、高剂量组(灌胃等体积不同质量浓度的乳源CGMP),灌胃周期为2周。于灌胃后第0、3、5、7、9、11、15天及停止灌胃后1周(第21天)采集的小鼠新鲜粪便,并进行粪便菌体基因组DNA抽提。依据双歧杆菌的16S rRNA基因序列设计5对种属特异性引物,以两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CICC6071的基因组DNA作为标准品,进行梯度稀释制作标准曲线;分析样品PCR扩增产物的熔解曲线,评价反应的特异性。结果表明:Real-time PCR可准确定量小鼠肠道内双歧杆菌数量;且灌胃中剂量乳源CGMP可以促进小鼠肠道内双歧杆菌的增殖,在灌胃第11天时小鼠肠道内双歧杆菌数量达到最高值,即乳源CGMP对小鼠肠道双歧杆菌的增殖作用存在剂量选择性。

摘要：研究旨在建立鹅GAPDH基因的Real-time PCR技术,为鹅功能基因m RNA表达水平的定量分析提供方法学基础。根据Gen Bank上鸭GAPDH基因的序列设计引物扩增鹅全长基因,以全长基保守区作为模板设计引物,采用SYBR GreenⅠ染料建立了Real-time PCR方法,以阳性重组质粒为标准品,建立标准曲线,并进行了熔解曲线分析。结果表明,所建立的方法具有快速、线性范围广以及重复性高等特点,研究结果为鹅GAPDH作为内参基因用于鹅相关基因定量表达分析奠定了基础。