摘要：建立一种快速检测变形杆菌的方法。采用实时荧光lamp(Real Amp)技术检测变形杆菌,分析Gen Bank中公布的变形杆菌atp D基因序列,针对其6个区域设计4条引物,利用实时荧光监测仪等温(62℃)扩增模板DNA,通过与电脑相连进行实时监测,对该方法检测变形杆菌的特异性、灵敏度、人工污染猪肉检出限等方面进行研究,并将该检测法的灵敏度与普通环介导等温扩增(lamp)检测法进行比较。结果表明,Real Amp检测方法比普通lamp检测方法更加方便快捷,20 min内即可判定结果;用于特异性试验的19株试验菌株中,6株变形杆菌呈阳性结果,其他13株非变形杆菌均呈阴性结果;检测纯菌的灵敏度为8.1CFU/m L,是普通lamp检测方法的10倍;人工污染猪肉的检出限为81CFU/m L。本研究建立的Real Amp检测方法操作简单,耗时短,特异性强、灵敏度高,能够实现对变形杆菌的快速检测。

摘要：斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus, CCV)属于大DNA病毒,是一种能引起斑点叉尾鮰(Letalurus punetaus)病毒性疾病的重要病原。研究以编码产物为磷酸激酶的CCV ORF77基因为靶标,设计了能识别靶基因上的8个独立区域的6条特异引物,利用基于环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, lamp)建立了用于CCV的实时荧光lamp快速检测方法。结果显示,建立的实时荧光lamp检测方法在63℃恒温反应45min条件下,反应大约12min后出现明显的峰值,最低检测限度为100个拷贝的病毒质粒DNA,检出时间为35min;并且具有良好的特异性,与白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)等常见水生动物病原DNA均没有交叉反应;同一样品于试验内及试验间重复性试验发现,20个平行样品的扩增曲线基本重合,表现出良好的重复性。通过对实际样品的检测结果显示,实时荧光lamp检测方法能够特异性的检出CCV。因此,研究建立的CCV实时荧光lamp检测方法操作简单、检测快速、特异性好、灵敏度高、结果可靠,能为斑点叉尾鮰养殖现场和实验室的斑点叉尾鮰疱疹病毒病病原的快速诊断和实时监测方面提供技术支撑。

摘要：为了建立原料乳中志贺氏菌快速检测的有效方法,提高志贺氏菌的检出效率。研究根据Gen Bank中志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因(ipa H),设计特异性lamp引物,将SYBR GreenⅠ荧光染料结合到lamp扩增技术中,通过实时荧光监测仪优化Mg^(2+)、d NTPs、温度和引物等反应条件,建立了实时荧光环介导等温扩增技术检测志贺氏菌的反应体系,对纯菌的菌悬液及原料乳人工污染样品中的志贺氏菌进行检测,并对该检测方法的特异性、灵敏度进行了研究,并与普通的lamp检测方法进行比较。结果表明,该检测方法特异性强灵敏度高,纯菌的菌悬液灵敏度和人工污染样品的检出限都能够达到100 cfu/m L,且灵敏度高于普通的lamp检测方法。综上所述,研究建立的实时荧光lamp检测方法灵敏度高、特异性强、耗时短,且检测结果直观易于分析,适用于快速准确监测原料乳中志贺氏菌的污染情况。