摘要：南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)是我国二类检疫性有害生物,以南方菜豆花叶病毒日本分离物(SBMV-J)总RNA为模板,采用rt-pcr方法扩增病毒外壳蛋白基因及其上游基因的cDNA片断并将其克隆到pMD18-T载体上。序列分析结果表明:SBMV-J cp基因由801个核苷酸组成,编码266个氨基酸,SBMV-J与其它分离物及株系cp基因的核苷酸序列同源性为83%～97%,氨基酸序列同源性为86%～97%。由于SBMV各分离物及株系cp基因的同源性较低,难于设计出较长的普通pcr引物。通过较短引物设计和TaqMan-MGB探针技术,建立了SBMV的实时荧光rt-pcr一步检测方法。该方法的检测低限是0．16 pg,最佳检测总RNA的量是0．16 ng。

摘要：洋葱黄矮病毒(Onion yellow dwarf virus,OYDV)是危害葱属植物的主要病毒之一。本试验根据OYDV外壳蛋白(coat protein,CP)基因保守序列设计特异性引物,建立并优化了OYDV实时荧光rt-pcr检测方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行了验证。结果显示:标准曲线Ct值与模板拷贝数的对数呈良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.996,扩增效率为95.921%;与青葱X病毒(Shallot virus X,SVX)、葱潜隐病毒(Shallot latent virus,SLV)均无交叉反应;最低检出限为2.0×10^(2) copies·μL^(-1),比常规rt-pcr大约高1000倍;组内和组间变异系数均小于2%,具有良好的重复性。利用该方法对分别采集的各45份疑似OYDV感染的分蘖洋葱(珠葱)和大蒜样品进行检测,检出率较常规rt-pcr分别高40.00、6.67百分点,能更加客观地反映样品带毒情况。本试验建立的OYDV实时荧光rt-pcr方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于田间样品OYDV检测,为OYDV的有效防控提供技术支持。

摘要：根据苹果茎沟病毒(ASGV)各分离物外壳蛋白(CP)基因的保守序列,设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan-MGB探针,建立了对ASGV的实时荧光rt-pcr检测方法。TaqMan-MGB探针3’端具有小沟结合分子(Minor groove binder, MGB),提高了探针的Tm值,缩短了探针长度,解决了病毒各分离物之间基因组变异较大、难以找到较长一致的序列来设计探针的困难。该方法的检测灵敏度比常规rt-pcr电泳检测高约10倍,对于ASGV等在果树体内含量较低的病毒尤为适用。此方法快速、灵敏,整个检测过程完全闭管,无需pcr后处理。

摘要：本研究以香石竹环斑病毒(Carnation ringspot virus,CRSV)的5个分离物为研究对象,根据CRSV运动蛋白(MP)基因的保守序列设计一对特异性引物和TaqMan荧光探针,建立了检测CRSV的实时荧光rt-pcr(real-timefluorescent rt-pcr)方法。该方法利用TaqMan探针水解产生的荧光信号实时监测目标基因的扩增,实现real-timefluorescent pcr扩增和检测同步进行。结果表明,本研究建立的实时荧光rt-pcr方法具有更快速、灵敏和特异的优点,与普通rt-pcr方法相比其灵敏度提高了100倍,适合于对进境种苗携带的CRSV的快速检测。

摘要：本研究选取辣椒轻斑驳病毒PMMoV、烟草花叶病毒TMV、黄瓜花叶病毒CMV和马铃薯Y病毒PVY作为试验材料,根据PMMoV衣壳蛋白(CP)RNA的序列特异性位点,设计出Taqman荧光探针及其引物,采用实时荧光rt-pcr技术对PMMoV进行快速检测,同时与ELISA方法进行了灵敏度比较,结果表明:该方法具有较高的灵敏度及较强的特异性,PMMoV检测结果为阳性,TMV、CMV和PVY均无荧光信号,为阴性,灵敏度是传统的ELISA方法的100倍,而且大大缩短了检测时间。该方法快速、准确、灵敏、简便、安全,具有实际应用价值,适用于植物病毒病害的快速检测。

摘要：齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)与建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)是严重危害兰科植物的2种主要病毒。本研究根据病毒不同分离株外壳蛋白基因的保守序列,分别设计了ORSV与CymMV各自的特异性引物与荧光探针,建立了基于TaqMan探针的实时荧光rt-pcr检测方法。该方法与酶联免疫检测方法相比,灵敏度提高104倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合对ORSV和CymMV的快速检测。应用该方法,从来自台湾的蝴蝶兰样品中检出齿兰环斑病毒。

摘要：为灵敏、快速检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV),根据PDCoVM基因保守区域设计引物和探针,建立了一种PDCoV实时荧光rt-pcr检测方法,并评价了该方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示,该方法的拷贝数对数值与Ct值在1.3×10^(3)-1.3×10^(7) copies/μL拷贝数浓度范围内呈现良好的线性关系,R^(2)=0.994;最低检出限为13 copies/μL,且无非特异性扩增;批内和批间重复性试验变异系数(CV)为0.24%~2.15%,均小于3%。利用该方法和普通rt-pcr对42份临床样品同时进行检测,发现本方法比普通rt-pcr灵敏性更高,二者符合率为95.2%。以上结果表明,本试验建立的实时荧光rt-pcr方法灵敏、特异、可靠,可用于PDCoV的临床检测和流行病学调查。

摘要：鸽A群轮状病毒(group A rotavirus,RVA)是影响养鸽业健康发展的主要病原之一。为实现鸽RVA的高通量快速检测,根据目前国内外流行的鸽RVA VP6基因保守区域设计特异性引物与探针,建立了一种可以特异性检测鸽RVA的实时荧光rt-pcr方法,并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行了评估。结果显示,该方法灵敏度高,最低检测限为7.22×10^(2)copies/μL;特异性强,与鸽群其他常见病毒无交叉反应;重复性好,组内与组间重复变异系数均小于1.5%。利用该方法和普通rt-pcr方法对200份临床样品进行检测,发现荧光rt-pcr方法的病毒阳性检出率高于普通rt-pcr方法,二者符合率为94.00%。结果表明,本研究建立的实时荧光rt-pcr方法敏感、特异、准确,重复性好,可为开展鸽RVA的临床检测及流行病学调查提供技术支持。

摘要：为更快速准确检测柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV),根据病毒外壳蛋白基因的保守序列设计特异性引物,通过体系优化得到最佳反应条件,建立基于SYBR GreenⅠ的CYVCV实时荧光rt-pcr检测方法。该方法可特异性检测CYVCV,而测试的柑橘衰退病毒、碎叶病毒等5种柑橘病毒均不能检测出。灵敏度较普通rt-pcr提高了100倍,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率和相关性系数分别为102%和0.999。对田间样品的检测结果表明,建立的实时荧光rt-pcr适用于检测不同柑橘品种中CYVCV的含量。

摘要：根据啤酒花潜隐类病毒(HpLVd)各分离物基因序列,设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan-MGB探针,建立了对HpLVd的实时荧光rt-pcr检测方法。通过对反应体系的优化,确定了HpLVd的实时荧光rt-pcr最佳反应条件:Mg2+终浓度为5.5 mmol/L,引物终浓度为0.7μmol/L,探针终浓度为0.5μmol/L。灵敏度对比试验结果显示,实时荧光rt-pcr的灵敏度较普通rt-pcr通过琼脂糖凝胶电泳高10倍,在25μL反应体系中,总RNA含量达到20 pg就能通过实时荧光rt-pcr检测出来。此方法也能成功检测田间样品上的啤酒花潜隐类病毒。