摘要：本研究自行设计了一个pcr反应池的模型,并对该反应池和反应样品的温度进行了理论计算,在此基础上进行了温度场动态分布仿真分析,仿真结果与理论计算相吻合,为自行设计的实时pcr仪的研发提供了理论基础。

摘要：目的通过检测孕妇外周血中的游离胎儿DNA来筛选重型β-地中海贫血胎儿。方法选择行产前基因诊断的夫妇6对,孕妇孕周23-26周。血液学检查:胎儿的父亲均为β-地中海贫血17M/N型,孕妇本人为携带除17M/N型之外的另一β-地中海贫血突变类型。针对CD17(A→T)无义突变,设计β-珠蛋白肽链上该等位基因的一对特异性引物和通过cycling probe法分别设计检测正常基因序列和基因突变位点的两条荧光探针,分别用FAM和HEX荧光标记。结合RT-pcr技术检测孕妇外周血中游离胎儿DNA,诊断胎儿是否遗传了其父亲的β地中海贫血17M/N碱基突变位点。同时与脐血血液学检查所诊断的胎儿地贫基因型对照。结果提取的6例孕妇血浆DNA模板中有3例同时显示FAM和HEX荧光信号值阳性结果,即这3例孕妇的胎儿遗传了父亲β-珠蛋白肽链上CD17位点的突变碱基(A→T)。另外3例孕妇血浆DNA模板的FAM信号值阳性,HEX信号值阴性,即所孕胎儿没有遗传父亲的CD17位点的突变碱基。结论利用RT-pcr和cycling probe技术检测孕妇外周血中的游离胎儿DNA可用来筛选患重型地中海贫血的胎儿。

摘要：目的建立一种快速、敏感、特异的大肠杆菌O157∶H7的定量检测方法。方法根据GenBank公布的O157∶H7大肠杆菌rfbE基因序列,应用分子生物学软件进行序列比对,在该基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对荧光定量pcr反应条件进行优化,建立实时荧光定量pcr检测大肠杆菌O157∶H7的反应体系,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。结果所有大肠杆菌O157∶H7菌株的检测结果均为阳性,而所有其它菌株检测结果均为阴性;该方法检测的灵敏度可达1cfu/μL,重复性检测的变异系数均小于5%。在模拟污染牛奶中,可检出1×102cfu/μL的细菌。从细菌核酸提取至完成检测约需3h。结论本研究建立的基于Taqman探针技术的实时pcr检测体系具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,可用于大肠杆菌O157∶H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。

摘要：目的建立TaqmanMGB实时荧光pcr技术快速检测登革病毒。方法利用TaqmanMGB技术，根据登革病毒3’端非编码区的一段高度保守序列，设计登革1～4型荧光pcr通用引物和TaqmanMGB探针，以登革热毒株作为标准，以乙脑毒株作对照，建立实时荧光pcr检测登革病毒的快速方法。并对8份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT-pcr及荧光pcr扩增。结果RT-pcr检测8份临床血清标本，2份阳性，阳性率为25％。实时荧光pcr检测登革病毒cDNA灵敏度为0．17pg／μl，病毒液灵敏度为10^-5TCID50与乙脑病毒无交叉反应，检测8份临床血清标本，5份阳性，阳性率为62．5％。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论TaqmanMGB实时pcr检测方法快速、敏感性高、特异性强，可作为登革病毒的快速检测方法，应用于登革热的临床早期诊断。

摘要：根据稻曲病菌核糖体转录间隔区(ITS)序列的特异性,设计了2对引物及相应TaqMan探针用于建立稻曲病菌实时pcr定量检测技术。结果表明,uvr292rf/uvr397rr/uvrp333组合建立的体系可特异性检测出稻曲病菌,扩增基线平整,指数扩增期明显,重现性好,最低可检出24fg的稻曲病菌基因组DNA模板量;以梯度稀释分生孢子液提取的基因组DNA为模板,建立孢子数量常用对数值与Ct值的线性关系,理论上最低可检测出0.67个分生孢子。对3个时间点的田间孢子捕捉样品进行检测,结果显示不同月份间稻曲病菌孢子数量存在差异。

摘要：为建立双歧制品中双歧杆菌快速、敏感、特异的检测方法,根据双歧杆菌16SrRNA/16SrDNA基因设计合成了双歧杆菌属特异性引物和分子信标探针,建立了快速检测双歧杆菌的分子信标-实时pcr检测方法,并对反应条件进行优化。检测方法重复性好,批内和批间变异系数均小于5%;特异性强,扩增曲线呈现明显的S型,无非特异性扩增;灵敏度高,是普通pcr的100倍,对纯双歧杆菌DNA的检出限为5.7fg/pcr反应体系,纯双歧杆菌菌液的检出限为2×103CFU/mL;线形范围宽,起始模板数在2×108CFU/mL～2×104CFU/mL之间具有良好的线性关系,相关系数大于97%。该方法具有灵敏、特异、简便和快速的特点,可用于对双歧杆菌原位菌数的定量检测。

摘要：建立了Taqman探针实时pcr方法,针对乳中携带sea基因的金黄色葡萄球菌进行检测。研究所设计的引物具有良好的特异性,而且Taqman探针实时pcr方法检测sea基因的灵敏度高,最低检出限为69 fg,并且该方法可在8 h内完成人工污染乳中金黄色葡萄球菌的检测,最低检出限为83 cfu/mL。研究所建立的方法具有特异性强、灵敏性高及操作简便等优点,适宜于牛乳中金黄色葡萄球菌污染的调查及监测。

摘要：目的建立改良分子信标双重实时pcr同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌的快速方法,应用于霍乱监测、副溶血弧菌食物中毒的快速诊断和海产品检验。方法根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位(ctxA)和副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素基因(TDH)的保守序列,分别设计引物和改良分子信标探针,以10种细菌作对照,建立双重实时pcr改良分子信标检测体系,应用于副溶血弧菌食物中毒快速诊断和霍乱监测。结果改良分子信标双重实时pcr反应体系DNA灵敏度为102.4～166.6fgμl,菌液灵敏度为32～64CFUml或3～6CFUpcr反应体系,无交叉反应。此反应体系同时检测40株副溶血弧菌和50株霍乱弧菌,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰。对3起细菌性食物中毒共48份样品和100份海产品进行检测,9份副溶血弧菌实时pcr阳性,其中7份副溶血弧菌细菌培养阳性,其余样品都为阴性。从样品处理到检测结果仅需1天时间。结论改良分子信标双重实时pcr检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于霍乱和副溶血弧菌食物中毒的快速诊断,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。

摘要：为了建立肉制品中猪源性成分检测的pcr方法,以猪线粒体细胞色素b(cytochrome b,Cyt b)为目的基因,设计猪特异性pcr引物;以猪、牛、羊、鸡及鸭DNA和不同稀释浓度猪DNA进行Real-time pcr反应,证明了该引物扩增具有物种特异性,检测低限可达5×10-5 ng/μL;设计内参基因β-actin通用引物,以猪源性成分含量0%~100%的混合肉样DNA为模板扩增,建立标准曲线,2-△△Ct值与猪源性成分含量有良好线性关系(R2=0.991 4);对猪源性成分含量0%~75%的混合肉样检测,回收率为99.85%~102.60%。应用建立的pcr方法检测了市售的6种品牌火腿肠,标识为清真食品的5种均未检测到猪源性成分,未标识清真食品的猪源性成分含量为12.70%。建立的实时荧光pcr检测方法操作简便、特异性强、所得数据可靠,为肉制品猪源性成分检测提供了新的手段。

摘要：根据松材线虫核糖体DNA内部转录区设计了一对特异引物F11/R11与探针TaqMan-11,构成松材线虫实时pcr检测方法。采用该检测方法对分离自枯死松树体内的松材线虫、拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫和长尾属线虫进行检测。结果显示,所有松材线虫株系都能够检测到荧光信号,而拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、长尾属线虫以及对照均没有检测到荧光信号。表明探针Taq-Man-11与引物组合对松材线虫具有很强的特异性。此外,利用检测方法,在10μL的反应体系中,最少可以检测到0.005pg的松材线虫DNA含量。实时pcr也可以成功地检测出单条松材线虫。