摘要：目的探讨建立快速鉴定角膜常见致病真菌的液相核酸芯片检测系统及其应用于真菌性角膜炎临床快速诊断的可行性。方法实验研究。设计针对5种角膜常见致病真菌（茄病镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、烟曲霉菌及黄曲霉菌）rRNA基因内转录间隔（ITS）区的种特异性探针，5’端氨基C12修饰后与不同荧光色的微球结合，建立液相核酸芯片检测系统。将目的真菌的5株标准菌株和42株角膜分离保存菌株的基因组DNA以一对真菌通用引物扩增并标记后用于杂交检测。实验中设市单一菌种榆测与多菌种混合检测的比较，以及芯片检测与琼脂糖凝胶电泳检测的比较，采用配对设计资料的t检验和Spearman等级相关分析对检测结果进行统计学分析，进而评估该检测系统的特异性、灵敏度和重复性。结果所建市的液相核酸芯片体系可在聚合酶链反应（PCR）后3h内准确将5株标准菌株鉴定至菌种的水平；42株角膜分离保存菌株单次检测阳性率达95．2％；阳件信号与背景比值位于5．6～13．3之间；单一菌种检测和5种菌种平行检测的中位荧光强度（MFI）差异无统计学意义（t=0．2524，P=0．8132）；MFI的变化与PCR产物的量呈正相关（rs=1．0000，P〈0．01）；最低检测浓度为0．94ngPCR产物，比琼脂糖凝胶电泳低40倍；4次重复检测的变异系数在1．8％-13．7％之间。结论所建立的液相芯片检测系统具有较高的特异性、灵敏度及重复性，可同时完成对5种角膜常见致病真菌的菌种检测，为液相芯片技术在临床真菌快速诊断中的应用奠定了实验基础。

摘要：目的建立比较成熟的可用于分析黄曲霉毒素生物合成相关基因的芯片技术。方法采用反转录PCR和芯片检测对比的方法。实验所用探针来源于寄生曲霉，待测样品选择黄曲霉菌株。结果芯片点阵后依次通过温浴2h，650mJ／cm^2紫外交联30s，80℃烘烤2h，预杂交45min，清洗，干燥等步骤，最后与待测样品在42℃杂交16h，获得了低背景高质量的芯片。芯片扫描显示荧光信号稳定，与反转录PCR扩增结果一致，并且无背景干扰。结论探针设计合理，实验方法可靠。初步建立了用芯片检测与黄曲霉毒素生物合成相关基因的技术平台。

摘要：目的检测牙周可疑致病菌密度感应信号系统luxS基因，了解其在牙周致病菌中的分布。方法选取牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌、具核梭杆菌的模式株、参考株及临床分离株作为研究对象，提取DNA，通过聚合酶链反应（PCR）、电泳鉴定和DNA测序，并利用GenBank数据库的Blast检测以上细菌luxS基因的存在情况。结果电泳鉴定存在目的条带，测序和Blast检测表明牙龈卟啉单胞菌PCR产物与目的基因有高度一致性（均为99％以上），具核梭杆菌测序结果与GenBank数据库的基因相同，伴放线放线杆菌电泳鉴定结果显示存在目的条带（750bp），与参考条带大小一致。结论本实验引物设计合理，能较好地扩增出牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、伴放线放线杆菌各实验菌株的luxS基因，为进一步研究luxS基因的功能奠定了基础。

摘要：目的观察疱疹病毒2型潜伏相关转录子开放阅读框架(HSV-2 LAT ORF)在病毒潜伏感染激活中的作用。方法体外建立HSV-2潜伏感染及复发的神经细胞模型,对病毒在细胞中的潜伏和激发进行PCR验证及测序;设计针对LAT ORF的siRNA,激活诱导后转染SH-SY5Y细胞,检测转染前后LAT ORF的表达改变;制备HSV-2基因表达谱芯片,利用芯片分析抑制LAT ORF后病毒基因表达的改变。结果在人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y上成功建立了HSV-2潜伏感染及激活的细胞模型,LAT、gG基因PCR扩增及电泳结果证实了病毒在细胞中的潜伏及激活;LAT ORF-siRNA转染细胞24、36、48h后,LAT ORF mRNA的表达水平分别降低了39%、51%和60%。基因芯片分析干扰后病毒基因表达,共有28个基因出现差异表达,其中24个基因下调,4个基因上调。结论 LAT ORF在HSV-2潜伏感染激活中发挥了重要作用,为下一步分析LAT在病毒潜伏激活中的调控机制奠定了基础。

摘要：目的 应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser DesorptionIonization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS）技术检测非综合征型耳聋患者突变基因,并用直接测序法进行验证,评估MALDI-TOF-MS在临床耳聋基因检测中的可行性.方法 采集454例非综合征型耳聋患者的外周血,提取基因组DNA,采用MALDI-TOF-MS检测常见的4个耳聋致病基因的20个位点,包括GJB2（35delG、167delT、176_191de116、235delC、299_300delAT）,GJB3 （538C→T、547G→A）,SLC26A4 （281C→T、589G→A、IVS7-2A→G、1174A→T、1226G→A、1229C→T、IVS15＋5G→A、1975G→C、2027T→A、2162C→T、2168A→G）,线粒体12S rRNA（1494C→T、1555A→G）.同时应用直接测序法对上述20个位点进行检测,以验证MALDI-TOF MS的准确性.结果 454例耳聋患者中共检出166例存在致聋突变（36.56％）.其中GJB2基因突变96例（21.15％）,GJB3基因突变4例（0.88％）,SLC26A4基因突变64例（14.10％）,线粒体12S rRNA基因突变3例（0.66％）.直接测序法结果与MALDI-TOF-MS结果一致,两者符合率达100％.结论 针对中国人群常见耳聋相关基因热点突变设计的MALDI-TOF-MS对非综合征型耳聋患者的突变检出率较高,与传统常用基因检测方法相比,具有检测位点多、覆盖率高、准确、高通量、低成本等特点,能够满足临床对常见耳聋基因检测的要求.

摘要：目的设计用于人巨细胞病毒(HCM V)诊断的60-m er长链寡核苷酸探针及微阵列。方法利用生物学软件A rray D es igner2.0,针对HCM V特异且保守的序列设计60-m er探针,利用BLA ST功能将设计探针在G enB ank数据库进行序列比对分析,筛选得到HCM V特异性O ligo探针,根据各探针的属性特点设计芯片阵列。结果设计得到24条解链温度(Tm值)相近、长度均一的60-m er O ligo探针及其芯片阵列,拟打印成DNA芯片用于HCM V检测。结论利用病原体的生物信息学资料及A rray D es igner2.0生物软件,能有效的进行病毒检测芯片的设计。

摘要：目的探讨基因芯片技术对于颅内感染致病菌快速检测的应用价值。方法选择4种常见致病菌以及6种常见耐药基因的特异DNA序列设计相应的引物与探针，对30例颅内感染患者的脑脊液标本（脑脊液培养阳性12例，阴性18例）进行多重PCR扩增、基因芯片检测，进行菌种鉴定和耐药基因检测，与脑脊液细菌培养及药敏检测结果进行比较。结果15例标本鉴定出菌种并检出耐药基因；8例未鉴定出菌种但检出细菌及耐药基因；7例未检出细菌及耐药基因。结论基因芯片可以相对灵敏、快速地用于颅内感染患者脑脊液中致病菌检测。

摘要：目的建立一种HBV耐药突变的反向杂交检测方法，并对该方法进行优化和评估。方法针对拉米夫定、阿德福韦酯和恩替卡韦3种药物10个耐药位点的常见耐药突变形式，合成兼顾HBV8种基因型的26条简并探针，并固定于同一张带正电荷的尼龙膜上，与地高辛标记的待测样本聚合酶链反应（PCR）产物进行杂交。为了提高检测灵敏度和特异性，从PeR产物标记地高辛的数目，紫外交联探针的能量强度，以及杂交和严格洗脱4个方面进行优化。为了证实方法的可行性，从检测特异性、灵敏度和临床标本的检测准确性3个方面进行评估。结果当检测体系为引物标记3个地高辛分子，紫外交联的能量强度选择1500×0．1mJ／cm2，杂交温度选择42℃，严格洗脱条件选择44℃，用0．5×SSC和0．1％十二烷基硫酸钠严格洗脱30min时，可获得灵敏、特异的结果。在该检测体系的评估中，当PCR产量在10mg／L以上，可以被检测到，且绝大多数探针特异性较好。临床标本的检测结果与直接测序法的检测结果符合率为93．9％（31／33）。结论该方法可以对HBV拉米夫定、阿德福韦和恩替卡韦耐药突变同时进行检测，是一种简便、快速、灵敏的分析方法，但部分探针的特异性有待进一步提高。对于180／181、202／204这4个位点的探针，由于两两距离较近，同一探针序列包含2个位点的密码子，杂交会相互干扰，通过组合距离较近的2个位点的密码子的各种形式来设计探针，可能有助于取得更好的结果。

摘要：目的利用基因芯片技术检测包括披膜病毒科甲病毒属、黄病毒科黄病毒属、布尼亚病毒科汉坦病毒属及SARS病毒等10种烈性RNA病毒。方法设计了甲病毒属的属保守区通用引物和黄病毒属的通用引物,与布尼亚病毒及SARS病毒的引物一起用于扩增靶核酸。另外,在通用引物所能扩增的区域内设计每种病毒的特异引物,利用该引物通过PCR反应制备cDNA克隆探针,在判定其特异性后,制备氨基化探针。对探针浓度、杂交温度、杂交时间、不同杂交液及杂交后芯片的洗涤方法进行了优化。结果核酸探针浓度为0·3μg/μl时,可获得杂交信号;在杂交液终浓度含20%甲酰胺、杂交60℃、1·5h的条件下,可分别获得以上10种病毒的特异杂交信号。利用多重PCR扩增靶序列时,可获得2种或4种混合病原体的特异性杂交信号。结论利用基因芯片技术检测病毒性病原体是可行的,关键在于设计合适的引物及探针序列。

摘要：目的建立能对虫媒病毒进行属水平筛查及种水平鉴定的基因芯片技术,为虫媒病毒提供一种高通量的检测与鉴定技术。方法从GenBank获得13种虫媒病毒的全部基因组序列,利用Clustal X和BLAST等比对软件,设计针对这些虫媒病毒所在的3个属的通用寡核苷酸探针,用于病毒的属水平筛查。然后设计针对每种病毒的特异性寡核苷酸探针,用于每种病毒的检测鉴定。寡核苷酸探针长度均为70mer,将设计好的探针与GenBank上所有病毒基因组序列进行比对,验证其种属特异性,然后进行探针合成和基因芯片制备。所有病毒在BSL-3和BSL-2实验室进行培养,待检病毒核酸通过锚定随机PCR进行扩增,经荧光染料标记后与基因芯片杂交,利用激光共聚焦扫描仪扫描后进行结果分析。结果所检测的13种虫媒病毒均可获得种特异性及所在属的属特异性杂交信号,非特异性杂交信号不明显。分别用两种不同的病毒混合后,进行模拟混合病毒感染,也得到了相应的特异杂交信号。结论初步建立了13种虫媒病毒的基因芯片检测技术,可用于这些病毒的属水平筛查及种水平鉴定,并且可以进行混合感染标本的检测,为虫媒病毒的检测与鉴定提供了一种新的手段。