摘要：目的:联合应用RNAdraw和Sfold软件设计并筛选低毒且高效抑制Hela细胞Ku70 mRNA表达的反义寡核苷酸。方法:从GenBank获得人Ku70 mRNA全序列,联合应用RNAdraw与Sfold软件,根据最小自由能原理设计多条20 nt的反义寡核苷酸,脂质体转染后MTT法检测其非序列特异性细胞毒性,选择毒性最小者并转染Hela细胞,RT-PCR检测转染前后Ku70 mRNA的表达水平并进行比较。结果:靶向Ku70 mRNA设计6条20 nt的反义寡核苷酸,其中NO.1序列非特异性毒性最低,对Hela细胞的生长抑制率(50、100和200 nmol.L-1浓度组分别为4.8%、9.5%和10.2%)与脂质体组比较差异无显著性(P>0.05),用毒性最低序列转染Hela细胞后使Ku70 mRNA表达水平显著降低(P<0.01),条带强度和面积与未转染组比较分别下降81.6%和77.6%。结论:联合应用计算机软件RNAdraw和Sfold对设计反义核酸有较大的指导意义,能实现较高的命中率,设计的反义寡核苷酸能有效抑制Hela细胞Ku70mRNA的表达。

摘要：目的　研究在转录起始区域设计硫代反义寡核苷酸抑制鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBVDNA)复制的可行性。方法　设计合成分别基于DHBVPreS1、PreS2、S抗原启动基因的硫代反义寡核苷酸 ,应用Southernblot实验和cpm计数测定其对原代鸭肝细胞中及雏鸭中感染DHBV的DHBVDNA的作用。结果　在 1.5 μmol L浓度下 ,体外抑制率分别是 61.5 % ,69.3 %和 62 .4%。选取PreS1抗原基因起始区段的硫代反义寡核苷酸进行整体动物实验。每只动物每天按 10 μg g体重静脉注射一次 ,共给药 6d。对动物肝脏进行取样分析表明 ,在此剂量下 ,对DHBVDNA的抑制率可达 87.9%。结论　本实验所设计的针对转录起始区的硫代反义寡核苷酸在体内外对DHBVDNA复制均有明显抑制作用 。

摘要：目的研制联合诊断HBV、HDV、HCV及HCV分型的寡核苷酸（Oligo）芯片，并进行系列优化及临床应用性研究。方法从GenBank数据库获取HBV全长DNA序列，HDV及HCV4个基因型全长cDNA序列，根据BLAST分析结果获得HBV、HDV种属保守序列及HCV各型特异性序列，以作为设计Oligo探针的备选序列。用Array designer 3．0分别对BLAST检索所得的HBV、HDV种属保守序列和HCV型特异性序列逐一进行分析，设计长度均一的60mer Oligo探针。从HBV、HDV、HCV种属保守序列和HCV型特异性序列中分别挑选出16、8、68条60 mer Oligo探针。Oligo探针合成和纯化后，用芯片打印仪固定在玻片上。为便于研究，先后制备了2种芯片，包括HBV、HDV诊断芯片、HCV分型芯片。采用限制性显示PCR技术进行样品荧光标记后与芯片杂交，并根据杂交结果筛除了有非特异杂交和信噪比低于4．0的探针，选取高特异的探针制备了HBV、HDV、HCV联合诊断分型芯片。结果从杂交效果来看，研制的Oligo芯片特异性较高，可有效用于HBV、HDV、HCV的联合诊断及HCV的分型。为了适应临床诊断的要求，对芯片进行了实验条件摸索和一些优化，均取得较好的效果。结论制备的肝炎病毒诊断分型芯片检测敏感性、特异性均佳，具有较为广阔的应用前景，为下一阶段进行中试规模的临床血清样品检测做好了准备。

摘要：为研究应用锁核酸（10ckednucleicacid，LNA）抗HBV的作用，我们设计针对HBVS基因的反义寡核苷酸，分别经过LNA、硫代反义寡核苷酸（phosphorothioateantisenseoligodeoxynucleotide，PS-ODN）修饰，以阳离子脂质体为载体介导转染HepG2．2．15细胞，比较它们对细胞表达HBsAg、HBeAg和复制HBVDNA的影响。

摘要：目的:构建针对人VEGF基因的小干扰RNA(siRNA)的表达载体,实现CMV启动子调控,转染肿瘤细胞后观察其对VEGF基因的干扰作用,并筛选出有效的VEGF-shRNA。方法:设计三对VEGF靶向的发夹状shRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入质粒pDC311-SV40-RC中,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹转染人骨肉瘤细胞U-2 OS,分别培养3d和7d后收集细胞培养上清液,ELISA检测上清中VEGF蛋白的表达。结果:将针对VEGF基因的siRNA的双链寡核苷酸片段成功克隆到pDC311-SV40-RC载体,经过阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确;转染U-2 OS细胞后,ELISA方法检测蛋白表达水平证实干扰序列3能有效降低VEGF的表达。结论:成功构建了CMV启动子调控的针对VEGF基因的siRNA载体,转染肿瘤细胞后可抑制VEGF的表达,并筛选出有效的干扰序列。

摘要：目的:研究核转录因子(nuclear transcription factorκB,NF-κB)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)转染人胃癌细胞SGC-7901后,对该细胞裸鼠体内致瘤性和血管新生的影响。方法:设计合成NF-κB基因激活亚基P65启动子区ASODN,转染胃癌SGC-7901细胞株,利用荧光染色法观察转染效果,MTT法检测细胞的体外生长抑制率。建立裸鼠荷瘤模型,观察该细胞裸鼠皮下成瘤生长曲线变化,利用HE染色和TUNEL法检测肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD)和凋亡指数(apoptotic index,AI)。结果:经P65ASODN转染的SGC-7901细胞体外增殖反应明显受到抑制(P<0.05)。体内成瘤实验结果显示,转染P65ASODN的SGC-7901细胞荷瘤裸鼠肿瘤体积明显小于其他各组(P<0.05),肿瘤组织的AI明显高于其他各组(P<0.01),肿瘤组织中的MVD明显少于其他各组(P<0.01)。结论:转染NF-κB/P65ASODN可明显抑制SGC-7901细胞的体内外增殖,该现象可能与P65ASODN诱导细胞凋亡,抑制肿瘤组织血管新生有关。

摘要：目的探讨寡核苷酸芯片在儿童急性淋巴细胞性白血病（ALL）融合基因检测中的应用。方法针对儿童ALL常见的5种融合基因：TEL／AML1、E2A／PBX1、BCR／ABLp190、BCR／ABLp210、MLL/AF4，设计特异的融合基因片段为芯片探针，合成后用点样仪点片制成寡核苷酸芯片。提取疾病初期白血病患儿的骨髓／外周血标本的总RNA，进行多重巢式逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、荧光标记并与芯片杂交，以检测白血病细胞中特异融合基因。结果该芯片可以从患儿骨髓样本RNA中准确检测到阳性内参序列、特异的融合基因以及融合位点。结论采用寡核苷酸芯片方法，可快速、同时筛选出5种染色体结构畸变产生的融合基因及融合位点，为ALL患儿危险分层、治疗选择、预后判断提供重要依据。此种方法应用于筛查初治白血病患儿融合基因表达时优缺点并存，具有一定临床实用价值。

摘要：选择大鼠主动脉平滑肌细胞作为细胞模型 ,观察丝裂原活化蛋白激酶 ( MAPK)信号通路在血小板源生长因子 ( PDGF)诱导的血管平滑肌细胞( VSMC)增殖中的作用。用 [3 H]Td R参入率作为衡量 VSMC增殖的指标 ,以 Western-印迹方法 ,用磷酸化一抗测 MAPK磷酸化的程度作为衡量 MAPK活性的指标 ,实验结果发现 ,PDGF( 0 .0 2 - 2 0μg·L-1)诱导 VSMC增殖呈剂量依赖性。 PDGF( 2μg· L-1)能持续性激活 MAPK。用 PD980 59( 1 0 -1 0 0 mol· L-1)预处理 1 5min后 ,MAPK活性较对照组均有明显差别 ( P<0 .0 5) .MAPK反义寡核苷酸能明显抑制 PDGF诱导的 MAPK的激活 ,并明显抑制 VSMC[3 H]Td R参入。上述结果表明 ,MAPK参与 PDGF促细胞增殖的信号途经 ,它的持续性激活与细胞增殖有关 ,针对 p42 /p44MAPK设计的反义寡核苷酸类能有效抑制 PDGF诱导的血管平滑肌细胞增殖。

摘要：为了研究修饰的反义寡核苷酸（ＡＳＯＮ）的抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）作用。以２．２．１５细胞为靶细胞，在ＨＢＶ前Ｃ／Ｃ基因区设计合成了１６聚硫代和脂肪链－硫代两种修饰的ＡＳＯＮ，用酶联免疫吸附和斑点杂交技术分别检测作用细胞的乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ），以及ＨＢＶＤＮＡ的分泌情况。结果显示，ＡＳＯＮ在浓度为１０μｍｏｌ／Ｌ时能特异性抑制细胞９２％～９５％ＨＢｓＡｇ和８４％～８７％ＨＢｅＡｇ的产生，并减少ＨＢＶＤＮＡ分泌，同时未见对细胞的毒性作用。ＡＳＯＮ在短时作用于细胞的情况下，脂肪链修饰的硫代ＡＳＯＮ的抗病毒活性显著高于未经脂肪链修饰者（Ｐ＜０．００２和＜Ｐ０．０５）。提示脂肪链修饰是今后ＡＳＯＮ药物设计和开发的一个新途径。

摘要：背景与目的多药耐药相关蛋白2(multidrugresistance-associatedprotein2,MRP2)在肝癌细胞过表达,是肝癌细胞多药耐药的主要原因之一。胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸中胞嘧啶甲基化可使基因静止不转录。本研究探讨人MRP2基因甲基化寡核苷酸(methylatedoligonucleotide,MON)抑制MRP2基因转录,增加肝癌细胞对化疗药物敏感性的作用。方法设计了与MRP2启动子区域互补的甲基化寡核苷酸(MON),实验设对照组、MON组、非甲基化寡核苷酸(nonmethylatedoligonucleotide,NON)组,MON及NON转染肝癌细胞系HepG2,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法分析转染后肝癌细胞对化疗药物敏感性的改变;逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)、流式细胞术检测甲基化寡核苷酸对多药耐药相关蛋白MRP2基因转录、蛋白质表达的影响。结果与对照组相比,MON可以显著抑制MRP2基因转录,下调HepG2细胞MRP2mRNA表达量,抑制MRP2蛋白质的表达,其作用有明显的剂量依赖性,1、2、4、8、16μmol/LMON转染后,MRP2蛋白阳性率分别为18.0%、9.15%、5.73%、3.73%、2.56%,而相同序列的非甲基化寡核苷酸则无此作用。化疗药物对甲基化寡核苷酸转染后HepG2细胞的IC50显著降低。结论MRP2甲基化寡核苷酸可以抑制肝癌细胞表面MRP2的表达,增加细胞内化疗药物的浓度。