摘要：根据小反刍兽疫Nigeria75/1株全基因组序列设计并合成PPRV特异引物,进而应用RT-PCR技术分5段扩增了PPRV全基因组cDNA。将扩增的各个cDNA重叠片段JF1、JF2、JF3、JF4和JF5分别克隆到载体上,建立了PPRV的初级cDNA克隆。在扩增5′末端时,引入AscI酶切位点和T7启动子序列;在基因组3′末段引入PacI酶切位点,后者供cDNA模板的线性化之用。将扩增片段再依次连接,最后亚克隆到质粒pok12中,获得了PPRV全长基因组cDNA克隆pok12-PPRV。通过序列同源性和进化树分析,结果表明,Nigeria75/1与MV和RPV的遗传关系最近。Nigeria75/1株全长cDNA的序列测定及构建,为拯救PPRV和在分子水平进一步深入研究PPRV打下坚实的基础。

摘要：通过分析小反刍兽疫病毒(PPRV)不同毒株的N基因序列,根据N基因保守区序列设计了1对引物,根据肌动蛋白基因序列设计了另1对引物作为内参,建立了小反刍兽疫RT-PCR诊断方法,预期扩增片段分别为687bp和493bp。以PPRVNigeria75/1株RNA和山羊组织总RNA混合物为模板,在RT-PCR反应体系内同时加入绵羊肌动蛋白基因引物和PPRVN基因引物,结果可扩增出2条目的条带,序列测定结果证实,分别扩增出了目的基因。对RT-PCR反应条件进行了优化,在最佳反应条件下,该RT-PCR最低可检测到12TCID50/mL的病毒RNA。用该方法对人工感染PPRVNigeria75/1株山羊的血液样品进行检测,结果可扩增出目的基因片段。表明建立的RT-PCR方法具有较好的特异性、敏感性和准确性。

摘要：根据GenBank中小反刍兽疫病毒(Nigeria75/1株)F基因序列设计了引物,应用RT-PCR方法获得了目的基因,纯化回收后将其连接到克隆载体pMD18-T上。将鉴定与序列测定后的目的基因再克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,经过鉴定,成功构建了含有小反刍兽疫病毒F基因的真核细胞表达载体pEGFP-N1-F。利用脂质体介导阳性pEGFP-N1-F质粒转染了BHK-21细胞。Western-blotting证实,表达的pEGFP-N1-F融合蛋白(90ku)具有免疫活性。

摘要：根据GenBank中已发表的小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria75/1株的H基因序列,设计上下游引物并添加BamHⅠ酶切位点,以含有小反刍兽疫病毒H基因的Topo-PPRVH质粒为模板进行PCR扩增,扩增产物克隆于pEASY-T载体中,用BamHⅠ单酶切后将目的片段连接到原核表达载体pET-32a(+)中,核酸序列分析证明,成功构建了PPRVH原核表达质粒pET-32a-H。将pET-32a-H重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行融合表达,经SDS-PAGE电泳,可见H蛋白获得了高效表达,融合蛋白的分子量约为87ku,表达产物以包涵体的形式存在,其表达量达到菌体总蛋白的38%,占包涵体蛋白的80%以上。Western blot鉴定表明,所表达的重组蛋白能被抗组氨酸单抗、抗PPRV标准阳性羊血清及抗PPRV疫苗的羊血清所识别,具有良好的免疫原性。

摘要：为研究小反刍兽疫病毒H基因过表达后对病毒增殖的影响,根据G en Bank中小反刍兽疫病毒疫苗株Nigeria 75/1 H基因序列,设计1对引物扩增H基因全长编码区序列,并将其连接至真核表达载体p EGF P-C 3上,经鉴定正确后转染CHS-20细胞,并通过R T-PCR、荧光观察及W estern-blot分别在m RNA和蛋白水平检测H基因的表达。结果表明,H基因在CHS-20细胞内得到了表达。将p EGFP-C3-PPRV H重组质粒、空载体p EGFP-C3转染CHS-20细胞,待H基因表达后,接种PPRV Nigeria 75/1,病毒增殖一定时间后,以β-actin作为内参基因,采用相对荧光定量RT-PCR法研究病毒增殖量的变化。结果表明,相对于未转染及转染空载体p EGFP-C3的细胞,转染p EGFP-C3-PPRV H重组质粒的细胞PPRV增殖量得到了提高,且差异显著(P<0.05),这说明在CHS-20细胞中过表达PPRV H基因能促进PPRV增殖。

摘要：为了掌握小反刍兽疫病毒(PPRV)H蛋白胞外区的功能,根据GenBank中已发表的小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株的H基因序列设计相应引物,分别克隆tH基因后构建原核表达载体pET-30a(+)-tH和真核表达载体pPIC9K-tH。将测序正确的重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)和酵母菌GS115,而后进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,tH蛋白均获得了高效表达,融合蛋白的分子质量约为60ku,原核表达产物以包涵体的形式存在,其表达产量为4.68g/L,而目的蛋白的真核表达产量为0.5~1g/L。Western-blot分析表明,所表达的重组蛋白能被抗PPRV Nigeria 75/1株的阳性家兔血清特异性识别。结果表明,成功表达了小反刍兽疫病毒H基因胞外区,重组表达蛋白具有良好的反应原性,这为PPRV H蛋白与其受体相互作用功能区的确定奠定了基础。

摘要：目的原核表达小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)F蛋白,并制备多克隆抗体。方法根据GenBank中登录的PPRV Nigeria 75/1株F基因全长序列,采用DNAStar软件设计去除F基因信号肽和跨膜区的引物,进行RT-PCR扩增,并克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,转化*** BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析,免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,并初步应用于PPRV的检测。结果重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPRV-F经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组F蛋白相对分子质量约59 000,诱导6 h表达量最高,且主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度可达95%以上;免疫小鼠制备的多抗能与纯化的重组蛋白发生特异性反应,抗体效价高于1∶64 000;间接免疫荧光试验显示,制备的多抗能够识别PPRV Nigeria 75/1株全病毒抗原。结论原核表达了PPRVF蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体,为其进一步研究及小反刍兽疫临床快速检测方法的建立奠定了基础。

摘要：为建立小反刍兽疫病毒（PPRV）可视化RT-LAMP检测方法,本研究根据PPRV基质蛋白（M）基因保守序列设计2对种特异性引物,通过反应条件优化和特异性、敏感性和临床样品的检测,建立了PPRV可视化RT-LAMP检测方法。结果显示,该方法最佳反应条件为62℃1 h,与口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、狂犬病病毒和犬瘟热病毒这5种羊常见病毒无交叉反应,最低可检测到2.4×10^（-9）ng/L的RNA,敏感性是普通RT-PCR检测方法的1 000倍。该方法与普通RT-PCR的总符合率为95.23%。结果表明,该方法具有敏感性高、特异性好、操作简便、快速和可视化的优点,可用于羊PPRV感染的现场可视化快速诊断检测。

摘要：为探索小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)非结构蛋白C(PPRV-C)的功能及其调节宿主细胞免疫抑制的分子机制,首先根据GenBank中PPRV-C蛋白基因序设计引物,通过PCR扩增获得PPRV-C蛋白基因,将其克隆至慢病毒载体PLVX-IRES-puro上,并命名为PLVX-IRES-puro-PPRV-C,随后连同辅助质粒共同转染HEK-293T细胞,收集上清,浓缩后测定重组慢病毒效价。用包装好的重组慢病毒感染绵羊外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)12 h后,换维持液继续培养,一定时间后收集细胞,检测PPRV-C的mRNA和蛋白表达水平;同时用空载体慢病毒做空白对照。结果显示:成功地构建了PPRV-C蛋白过表达重组慢病毒载体,包装的重组慢病毒效价为(9.6±8.8)×107TU/m L。重组慢病毒感染(MOI=10)后,检测到PPRV-C蛋白mRNA的转录和蛋白的表达结果表明,构建的PPRV-C慢病毒能在PBMCs中高效表达,同时也为今后进一步研究PPRV-C蛋白的功能奠定了基础。

摘要：目的对小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)弱毒疫苗株血凝素蛋白(H)主要抗原表位区进行克隆及原核表达,并制备鼠抗PPRV H蛋白多克隆抗体。方法根据Gen Bank中登录的PPRV弱毒疫苗株H基因序列设计引物,RT-PCR扩增其主要抗原表位区域(去掉信号肽及跨膜区);将扩增产物克隆至表达载体p ET-30a(+)后,转化*** Transetta(DE3),经IPTG 37℃诱导表达目的蛋白;表达的目的蛋白经带His标签的镍离子蛋白纯化柱纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定;将纯化的H蛋白与弗氏佐剂混合乳化后免疫昆明鼠,3次免疫2周后采血,分离血清,制备鼠抗PPRV H蛋白多克隆抗体,采用间接免疫荧光试验进行鉴定。结果质粒p ET-30a(+)-H经双酶切鉴定证明构建正确;表达的目的蛋白相对分子质量约60 000,能同时被抗His标签抗体和PPRV阳性绵羊血清识别,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的48%,纯度可达90%以上;制备的多克隆抗体能够识别PPRV全病毒抗原以及杆状病毒表达的重组PPRV H蛋白。结论成功构建了质粒p ET-30a(+)-H,并表达了PPRV H蛋白,制备的鼠源多克隆抗体为建立针对PPRV H蛋白的ELISA抗体检测方法及研制新型亚单位疫苗奠定了基础。