摘要：目的研究人β-防御素-3(human beta-defensin-3,hBD3)对肠上皮细胞自噬的调节作用及其介导的自噬调控对肠上皮细胞迁移的影响。方法应用雷帕霉素(Rapamycin)诱导肠上皮细胞IEC-6构建细胞自噬模型。根据实验设计分为对照(Control)组、雷帕霉素(Rapamycin)组和人β-防御素-3(hBD3)+雷帕霉素组。蛋白质印迹法检测各组肠上皮细胞自噬相关蛋白表达水平,mRFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒感染肠上皮细胞动态监测自噬流。应用CXCR4抑制剂和siRNA进一步验证hBD3调控自噬的潜在机制。划痕实验检测肠上皮细胞迁移能力,通过ATG7 siRNA转染的肠上皮细胞进一步佐证hBD3是通过调控自噬从而影响肠上皮细胞迁移。采用随机数字表法,将新生大鼠随机分为对照组+生理盐水(Control+NS,n=11),坏死性小肠结肠炎造模组+生理盐水(NEC+NS,n=12)和坏死性小肠结肠炎造模组+hBD3(NEC+hBD3,n=8)。通过配方奶喂养+缺氧冷刺激诱导构建坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC)模型鼠,收集肠管组织检测自噬相关基因表达。结果蛋白免疫印迹法检测自噬相关蛋白结果显示,雷帕霉素组中应用200 nmol/L雷帕霉素处理IEC-6细胞24 h后,自噬相关蛋白p62、Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ相较于对照组的表达量分别为0.44±0.05、1.17±0.05和1.32±0.05,均较对照组差异有统计学意义(P<0.001,P=0.026和0.0014),成功构建了肠上皮细胞自噬模型。hBD3+雷帕霉素组IEC-6细胞中p62、Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ相较于对照组的表达量分别为0.86±0.04、0.75±0.04和0.95±0.03,与雷帕霉素组比较,差异亦有统计学意义(P=0.009、0.0027和0.003),提示hBD3预处理可以显著抑制肠上皮细胞自噬水平。雷帕霉素组mRFP+GFP+斑点和mRFP+GFP-斑点计数分别为(38.33±2.02)个和(72.33±2.61)个,较对照组(3.67±0.88)个和(4.67±1.20)个明显增加,组间比较,差异有统计学意义(P均<0.0001);hBD3+雷帕霉素组mRFP+GFP+斑点和mRFP+GFP-斑点数分别为(14.67±1.76)个和(16.00±2.41)个,均较雷帕霉素组明显减少,组间差异有统计学意义(P均<0.0001),提示hBD3对IEC-6细胞自噬流有抑制作用。AMD3100+hBD3+雷帕霉素组IEC-6细胞中p62、Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ相较于对照组的表达量分别为0.22±0.04、0.91±0.02和1.16±0.02,与hBD3+雷帕霉素组比较,差异有统计学意义(P=0.0004、0.0223和0.005),而CXCR4 siRNA+hBD3+雷帕霉素组IEC-6细胞中p62、Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ相较于对照组的表达量分别为0.39±0.03、1.02±0.04和1.13±0.02,与hBD3+雷帕霉素组相比,差异有统计学意义(P=0.0008、0.0096和0.011),提示阻断或沉默CXCR4可有效逆转hBD3对自噬的抑制作用。雷帕霉素组肠上皮细胞迁移速率为0.58±0.04,hBD3+雷帕霉素组肠上皮细胞迁移速率为0.86±0.03,两项比较,差异有统计学意义(P=0.0063)。转染ATG7 siRNA后,雷帕霉素组和hBD3+雷帕霉素组的肠上皮细胞迁移速率分别为0.95±0.04和0.99±0.02,组间比较,差异无统计学意义(P=0.089)。NEC+NS组中自噬相关基因Beclin1和LC3的表达量分别为2.01±0.06和2.49±0.09,较Control+NS组(0.96±0.04和1.01±0.02)和NEC+hBD3组(0.78±0.07和1.06±0.08)显著增加,组间差异有(0.78±0.07、1.06±0.08,P均<0.001)。结论新生大鼠坏死性小肠结肠炎模型的肠管组织中自噬相关基因过度激活,hBD3通过与CXCR4结合能明显抑制肠上皮细胞自噬且hBD3介导的自噬抑制是其促进肠上皮细胞迁移的可能机制之一,从而对新生大鼠坏死性小肠结肠炎发挥保护作用。

摘要：目的利用新生SD大鼠建立缺氧、冷刺激、鼠乳代用品人工喂养等多因素造成的新生鼠坏死性小肠结肠炎动物模型,并对其进行评价。方法按析因设计,32只新生SD大鼠出生48h开始随机分成4组,每组动物各8只。A组采用鼠乳代用品人工喂养,并给予100%氮气缺氧90s,4℃冷刺激10min,每天2次,连续3d;B组为单纯采用鼠乳代用品人工喂养,未进行缺氧冷刺激;C组采用鼠乳喂养,给予同样的缺氧冷刺激;D组为正常对照组,采用鼠乳喂养,未进行缺氧冷刺激。HE染色后光镜下观察回盲部近端肠组织形态学改变,采用肠损伤病理评分进行评价,组织学评分≥2分确定为坏死性小肠结肠炎(NEC)。结果A、B、C组新生SD大鼠相继出现腹泻、腹胀、萎靡、活动减少,生长减慢,A组程度最为严重。A、B、C、D4组肠损伤病理评分(x-±s)分别为(3.25±0.89)分、(2.63±0.92)分、(1.13±1.36)分、(0.25±0.46)分,各组间差异均有统计学意义(H=19.30,P<0.01)。NEC发病率分别为100%、87.5%、37.5%和0。喂养方式和缺氧冷刺激为肠组织损伤病理评分值影响因素,两因素间无明显交互作用。结论新生鼠在剔除鼠乳喂养,改用鼠乳代用品人工喂养的前提下,经过连续多次的缺氧冷刺激后,诱导的新生鼠坏死性小肠结肠炎模型与人类新生儿NEC临床特征、病理改变相一致,是一种理想的新生儿坏死性小肠结肠炎动物模型。

摘要：目的探讨添加天然蒙脱石对新生鼠坏死性小肠结肠炎(NEC)模型肠损伤保护作用及对肠组织中分泌型磷脂酶A2(sPLA2)含量变化的影响,为预防性应用天然蒙脱石防治NEC提供依据。方法新生SD大鼠出生后48h开始给予鼠配方奶喂养,100%氮气缺氧90s,4℃冷刺激10min,每天2次,连续3d,建立新生鼠NEC模型。按析因设计,32只新生SD大鼠分成4组,A1B1组为NEC模型组,在出生48h起每日给予天然蒙脱石灌胃,剂量为0.6g·kg-1·d-1,每日3次;A1B2组为NEC模型组,未添加天然蒙脱石;A2B1组为对照组,给予天然蒙脱石灌胃,每日3次,0.6g·kg-1·d-1;A2B2组为对照组,未添加天然蒙脱石。每组动物各8只。在最后一次缺氧、冷刺激后24h空腹断头处死大鼠,留取十二指肠下端至直肠上端肠管进行肠组织损伤评分和肠组织中sPLA2含量检测。肠损伤组织学评分≥2确定为NEC;新生鼠肠组织中PLA2含量采用ELISA双抗体夹心法检测。应用Kruskal-Wallis H检验和析因设计的方差分析进行统计学分析,α=0.05为显著性检验标准。结果 A1B1组、A1B2组新生SD大鼠出现腹泻、腹胀、萎靡、活动减少、生长减慢,A1B1组程度较轻。A1B2组肠组织损伤评分和肠组织中PLA2含量显著高于A2B2组、A2B1组;与A1B2组相比,A1B1组肠损伤组织评分明显降低,肠组织中PLA2含量亦明显减少,但仍高于A2B1组、A2B2组;在控制造模因素后,添加天然蒙脱石组和没有添加天然蒙脱石组肠损伤组织评分的边缘估计均值及95%CI为:0.79(0.62,0.96),1.83(1.67,2.00),PLA2含量边缘估计均值及95%CI分别为:0.785(0.581,0.990),1.159(0.954,1.364),差别均有统计学意义。结论添加天然蒙脱石可降低NEC新生大鼠肠损伤程度,降低其肠组织中PLA2含量。

摘要：目的建立新生SD大鼠坏死性小肠结肠炎(NEC)模型,探讨添加双歧杆菌对新生大鼠NEC模型肠损伤的保护作用及肠道菌群的影响,为应用双歧杆菌防治NEC提供依据。方法SD新生大鼠出生48h开始给予鼠配方奶人工喂养,100%氮气缺氧90s,4℃冷刺激10min,每天2次,连续3d,建立新生SD大鼠NEC模型。按析因设计,32只新生SD大鼠随机分成4组,每组动物各8只。A组为NEC模型组并在出生48h起每日给予长双歧杆菌灌胃(1×108CFU/d);B组为NEC模型组,C组为对照组,都未添加双歧杆菌;D组为对照组并给予长双歧杆菌灌胃(1×108CFU/d)。在最后一次缺氧、冷刺激后24h空腹断头处死大鼠,留取回盲部近端肠管组织进行肠组织损伤评分,组织学评分≥2确定为NEC;实验前后留取各组新生鼠粪便,按照张秀荣方法进行肠道菌群检测。应用Kruskal-WallisH检验等方法进行统计学分析,α=0.05为显著性检验标准。结果开始造模后,A、B组新生SD大鼠相继出现腹泻、腹胀、萎靡、活动减少,A组程度较轻。A、B、C和D组肠组织损伤评分(x±s)分别为1.88±0.84、3.13±0.84、0.63±0.52、0.50±0.54,各组间肠组织损伤评分差异有显著性,与B组相比,A组肠组织损伤评分明显降低,但仍高于C、D两组,差异均有显著性。各组实验前肠道细菌总数,杆菌、球菌数,G+杆菌、G+球菌数差异均无显著性,肠道菌群中杆球菌比值在正常范围中。实验结束时,各组间新生鼠肠道细菌总数,杆菌、球菌数,杆球菌比值,G+杆菌、G+球菌数及其占肠道总菌群数的比率差异均有显著性;除B组杆菌数外,与实验前相比,各组新生大鼠实验结束后肠道细菌总数、球菌数、杆菌数、G+杆菌数、G+球菌数均有显著增加,差异均有显著性;A、B组肠道杆球菌比值和G+杆菌数占肠道总菌群数比率均明显下降,A组下降幅度较少,B组G+球菌占肠道总菌群数比率明显增加。B组肠道球菌数、杆球菌比值、G+杆菌/G+球菌占总细菌群数比率均高于C、D组,差异有显著性;与B组相比,A组肠道杆菌、G+杆菌数明显增加,G+球菌数及其占总细菌群数比率明显降低,差异均有显著性。结论添加双歧杆菌可以降低由人工喂养、缺氧冷刺激所引起的新生大鼠肠损伤程度,具有抗NEC的保护作用。