摘要：目的:用CRISPR/Cas9技术构建稳定表达的ITGA2B c.2659C>T (p.Q887X)无义突变的血小板无力症小鼠模型,并对其血小板膜表面糖蛋白αIIbβ3的功能做进一步研究。方法:根据ITGA2B基因信息设计并合成针对c.2659C位置的供体寡核苷酸和g RNA载体并进行体外转录。将g RNA和Cas9 m RNA与供体寡核苷酸共注射到受精卵,并送回到代孕鼠输卵管中。鼠出生后进行PCR基因分型和序列分析,获得阳性F0鼠。阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代,获得经PCR和测序验证的F1代杂合型点突变GT小鼠,而后F1代小鼠通过彼此交配得到纯合型点突变GT小鼠以及对照组WT小鼠。通过检测小鼠鼠尾出血时间和隐静脉出血时间、血小板聚集功能、血小板表面αIIbβ3的表达和功能,对该小鼠模型的表型进一步验证。结果:小鼠鼠尾出血实验表明,GT小鼠割尾后的出血时间较WT小鼠明显延长(PT (p.Q887X)无义突变的GT小鼠模型。该小鼠模型血小板聚集功能缺陷,符合血小板无力症的表现。

摘要：原发性家族性脑钙化症(primary familial brain calcification,PFBC)是慢性进展性的神经系统遗传病,临床症状主要包括运动障碍、认知障碍及精神障碍等,其致病机制尚未完全明确。研究表明SLC20A2是该病最主要的致病基因。由于Slc20a2基因全身性敲除小鼠模型会导致胎儿生长受限,为更好地研究PFBC发病机制,本研究应用CRISPR/Cas9技术构建了纹状体Slc20a2基因条件性敲除小鼠模型。首先,针对Slc20a2基因编码区,设计3条靶向exon3的sgRNA(single guide RNA),通过构建质粒、转染细胞、Surveyor assay等实验验证sgRNA的活性。其次,选取活性较高的sgRNA重组包装AAV-Cre病毒,应用立体定位将AAV病毒定点注射于小鼠纹状体。体外实验结果表明设计的3条sgRNA均能够有效地介导Cas9切割靶DNA。细胞免疫荧光实验结果证实AAV-Cre病毒具有Cre重组酶活性。最后,通过小鼠脑部组织免疫组化、TA-克隆、高通量测序及Western blot方法检测Slc20a2基因敲除效率,发现实验组小鼠纹状体组织Slc20a2表达明显降低。本研究成功设计了3条能够敲除Slc20a2的功能sgRNA,并应用CRISPR/Cas9技术成功构建了纹状体Slc20a2基因条件性敲除小鼠,为研究PFBC的发病机制提供了有效的动物模型。

摘要：目的:构建Cyp4v3^(-/-)小鼠模型以模拟人类结晶样视网膜变性(Bietti crystalline dystrophy,BCD)患者的临床症状,为进一步探索BCD的致病机制和基因治疗方案奠定基础。方法:利用clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/Cas9技术,设计sgRNA,注射入C57BL/6J小鼠受精卵中构建携带定点突变的小鼠模型。提取小鼠DNA确定其基因型,分别在其3、6、12月龄时以野生型(wild type,WT)的C57BL/6J小鼠为对照组,进行眼底彩照检查观察其眼底结晶沉积情况;用视网膜电生理(electroretinogram,ERG)检查视网膜功能;用冰冻切片免疫荧光染色观察视网膜组织结构;视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)铺片鬼笔环肽染色观察RPE形态结构。结果:Cyp4v3^(-/-)小鼠随着年龄增长,可模拟BCD患者的一些临床症状。在疾病早期未发现眼底有结晶样沉积,ERG检测其视网膜功能未发现明显下降,神经视网膜及RPE的形态结构及数量均未发生明显变化。随着Cyp4v3^(-/-)小鼠年龄增长,眼底彩照在6月龄时发现有结晶样沉积,12月龄时沉积消失但色素沉积,RPE萎缩;ERG检查在6月龄时发现有暗适应波幅下降,12月龄时暗适应和明适应波幅均有明显下降;免疫荧光染色显示Cyp4v3^(-/-)小鼠神经视网膜层形态结构受疾病影响不严重;RPE铺片鬼笔环肽染色显示,12月龄时Cyp4v3^(-/-)小鼠RPE细胞六边形形态改变,排列松散,与WT小鼠相比同等大小视野范围内RPE细胞数量明显减少且差异有统计学意义(P=0.011)。结论:Cyp4v3^(-/-)小鼠疾病表型与年龄相关,与人类BCD患者临床症状有相似之处,为进一步研究BCD发病机制和基因治疗策略提供了好的模型;本研究发现BCD病理改变首先发生在RPE,但是具体机制还需进一步研究。

摘要：目的利用CRISPR/Cas9技术构建MMACHC基因c.80A>G(p.Q27R)纯合突变的cblC型甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症小鼠模型。方法利用CRIPSR/Cas9基因编辑技术,将小鼠MMACHC基因第80位碱基由碱基A突变为碱基G,在靶位点区域设计单链导向RNA(single-guide RNA,sgRNA),构建打靶载体,将Cas9/sgRNA及打靶载体显微注射到小鼠受精卵中,培育获得F0代小鼠,以小鼠鼠尾鉴定基因型,将点突变阳性F0代小鼠与野生型小鼠交配获得具有稳定基因型的F1代小鼠,F1代小鼠交配繁育获得MMACHC基因c.80A>G纯合突变型小鼠,对纯合型小鼠、杂合型小鼠、野生型小鼠进行血代谢产物甲基丙二酸和总同型半胱氨酸检测。结果获得12只MMACHC基因c.80A>G点突变阳性的F1代小鼠,并进行培育繁殖扩大种群,获得纯合突变型小鼠,纯合型小鼠无早期死亡,其血甲基丙二酸、总同型半胱氨酸水平显著高于杂合型和野生型小鼠(P0.05)。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建MMACHC基因c.80A>G(p.Q27R)纯合突变的cblC型甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症小鼠模型。

摘要：种植体周围炎是口腔种植修复最常见和棘手的并发症,是影响种植修复远期效果,导致种植失败的主要原因之一.由于研究手段的局限,其发病机制及病理过程尚未明确.动物模型是研究疾病发病机制的重要工具,随着种植技术的日臻成熟,种植体周围炎小鼠模型开始被用于基础实验研究.本文将结合国内外学者近年的研究进展,从小鼠模型的优势、小鼠品系的影响、微种植体的设计、微种植体植入的方式以及小鼠种植体周围炎的诱导方式五个方面进行综述,旨在为相关研究者提供参考和帮助.与种植体周围炎大动物模型相比,种植体周围炎小鼠模型使用更加灵活,较低的成本可以更好地控制样本量的大小,更短的建模时间可以更好地控制实验周期,小鼠基因组测序的完成,以及遗传操作系统的成熟使其发病机制的研究成为可能.但是,目前种植体周围炎小鼠模型仍存在一定的局限性,比如由于小鼠口腔大小的限制,种植手术操作的难度较大,复杂的干预措施难以实施,且由于种植体周围炎小鼠模型发展时间较短,种植体植入方法、种植体周围炎诱导方法等相关技术理论尚不统一,仍需要进一步地研究夯实理论.

摘要：目的通过卵清蛋白(OVA)腹腔注射致敏与眼部多次激发的方法建立过敏性结膜炎小鼠模型。设计实验研究。研究对象SPF级、6~8周龄BALB/c小鼠20只。方法将20只小鼠随机分为正常对照组(PBS组)和过敏性结膜炎组(OVA组),每组10只。OVA组于第0、2、4、6、8天,分别在小鼠腹腔注射200μl卵清蛋白致敏液。于第10、11、12、13、14天,分别在小鼠双眼点眼卵清蛋白激发液10μl。PBS组同上操作,将腹腔注射液和滴眼液替换为PBS。于过敏激发液点眼15~30分钟裂隙灯下观察眼表状态,取材后吉姆萨染色评估炎性细胞浸润程度及免疫组化染色检测炎性因子表达情况。通过裂隙灯评估过敏性结膜炎症状,包括眼睑水肿、结膜水肿,结膜充血和溢泪四项,同时观察小鼠的10分钟挠眼次数;第15天将小鼠处死,分离小鼠脾脏,称重,计算脾脏指数;运用免疫组化检测白介素(IL)-8、IL-6、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的表达,同时用吉姆萨染色,评估炎性细胞的浸润情况。主要指标过敏性结膜炎症状评分、挠眼次数、脾脏指数、IL-8、IL-6、TSLP的表达水平和炎性细胞的浸润情况。结果OVA组小鼠存活率为100%。与PBS组相比,OVA组小鼠表现出明显的脾脏肿大,眼睑水肿,充血和溢泪。第10、11、12、13、14天时OVA组的症状评分均高于PBS组,分别为3.1±1.45、6.6±1.71、5.7±1.34、6.4±1.51、10.1±1.66和1.3±0.95、1.9±0.99、1.7±0.82、1.3±1.06、1.4±0.84(P均<0.05);OVA组小鼠挠眼次数均多于PBS组,分别为28.8±5.88、29.3±7.42、27.2±8.2、28.0±6.82、26.2±5.09和12.3±4.32、12.7±5.03、13.3±5.62、12.7±5.54、16.4±2.67(P均<0.05)。15天时,OVA组高于小鼠的脾脏指数高于PBS组,分别为6.67±0.66和4.21±0.40(t=10.02,P=0.0001)。PBS组小鼠TSLP的平均光密度值低于OVA组,分别为10.23±1.52和20.25±1.75(t=7.482,P=0.0017),IL-6的平均光密度值分别为13.15±1.68和24.93±3.02(t=5.911,P=0.0041),IL-8的平均光密度值分别为12.23±3.22和22.12±4.00(t=3.337,P=0.0289)。OVA组的结膜组织中观察到明显嗜酸性粒细胞浸润,计数为(1366.67±57.74)/mm^(2),PBS组小鼠为(266.67±57.74)/mm^(2)(t=23.33,P=0.0001)。结论采用卵清蛋白腹腔注射致敏与眼部多次激发的方法成功建立过敏性结膜炎小鼠模型,可为人类过敏性结膜炎机制研究及药物研发提供简便可靠的实验工具。(眼科,2021,30:189-194)

摘要：抑郁和抗抑郁表型的基因敲除小鼠、敲减小鼠的发展利于更好地理解基因、环境和后天因素在抑郁症发生中的作用与关系。5-羟色胺（5-HT）神经传递的功能障碍是抑郁症共同的标志，利用基因工程技术对5-HT系统中重要的转运体、受体、蛋白、酶等基因进行敲除或敲减制成的基因工程小鼠模型具有抑郁和抗抑郁表型。文章综述了十种有代表性的基因工程小鼠模型（5种抑郁表型、5种抗抑郁表型），分别从其生理功能、分子机制、行为学表型、神经生理学改变乃至这些基因所对应的人体层面的研究进行了总结，而人体层面研究的发现有助于设计和建立新的基因小鼠模型，用于探索新的抑郁症的发病假说，从而为探索新的抗抑郁药物提供依据。

摘要：移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）主要发生于造血干细胞移植、输注富含白细胞的血液与血液成分以及大器官移植术后。异体移植物中存在的成熟T细胞不仅能重建受者体内的细胞免疫，而且能清除受者体内的恶性细胞。但这些T细胞识别受体作为“非己”，

摘要：目的:构建肌节同源盒基因1(Msx1)-Cre小鼠模型。方法:基于CRISPR/Cas9技术,设计靶向切割Msx1基因启动子下游的单链向导RNA(sgRNA),并构建包含Cre序列的同源重组片段;构建sgRNA载体质粒,转染至小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3),并在细胞水平验证sgRNA的打靶效率和脱靶情况;将靶向切割Msx1基因的sgRNA、Cre同源重组片段及Cas9蛋白等混合溶液经体外显微注射至C57BL/6J小鼠的受精卵,3周后获得小鼠,利用PCR技术鉴定获得的F0代Msx1-Cre小鼠,并将构建成功的Msx1-Cre模型小鼠与Rosa26R-mTmG模型小鼠交配,进行功能验证。结果:设计的sgRNA能够有效定点切割Msx1基因启动子下游靶位点;成功获得Msx1-Cre小鼠模型;Msx1-Cre模型小鼠与Rosa26R-mTmG模型小鼠交配,子代小鼠免疫荧光结果显示,小鼠绿色荧光蛋白(GFP)特异定位于表达MSX1细胞的细胞膜上。结论:成功构建了Msx1-Cre小鼠模型,可用于示踪Msx1基因以及在表达MSX1的牙间充质细胞中进行条件性敲除或过表达实验来研究牙发育过程中特定基因的功能。

摘要：目的:探究CRISPR/Cas9技术在建立亨廷顿病(Huntington’s Disease,HD)原位敲入小鼠模型中的运用。方法:首先,设计gRNA靶点序列(Htt gRNA)并检测其体外Cas9酶切活性,选择活性较好的一对备用。其次,利用全基因合成具有150Q(150个CAG重复)的Donor序列。然后将Cas9 mRNA,Htt-L3 gRNA,Htt-R3 gRNA和Donor DNA混合均匀进行胚胎显微注射,再将胚胎移植到受体小鼠中备孕。待小鼠出生后,鉴定F0代及其子代F1,F2,F3代的基因型。结果:F0,F1,F2及F3代小鼠基因组上均出现150Q的准确敲入,且子代稳定遗传。结论:在不改变小鼠HD基因表达调控的基础上,仅改变其特定致病基因的长度,利用CRISPR/Cas9技术成功构建HD原位敲入小鼠模型,为进一步模拟人类HD缓慢且迟发的发病过程及后续临床治疗研究拓展了HD模型。