摘要：目的建立小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)的逆转录-重组酶聚合酶扩增(reverse-trancription recombinase ploymerase amplification,RT-RPA)检测方法。方法以GenBank中登录的MHV-FJ株(FJ6647223)M基因保守区段(82~317 bp)为靶基因,设计合成6对RPA扩增引物(M-MHV-1~6),筛选1对最适引物,同时优化反应温度(31、33、35、37、39、41℃)和时间(20、25、30、35 min),并验证该方法的特异性和敏感性。采用优化方法检测32份野生田鼠肝脏组织样本,并与RT-PCR法检测结果进行对比。结果筛选最适引物为M-MHV-2,最适反应温度和时间分别为37℃和30 min。该方法的检测下限为4.75×10;copies/μL,对鼠肺炎病毒(Pneumonia virus of mice,PVM)、仙台病毒(Sendai virus,SV)、汉坦病毒(Hantaan virus,HV)、鼠细小病毒(minute virus of mice,MVM)、呼肠弧病毒Ⅲ型(reovirus typeⅢ,ReoⅢ)无交叉反应。32份野生田鼠肝脏组织样本中,检测出阳性样本1份,检出率为3.13%(1/32),与RT-PCR检测结果一致。结论建立了MHV的RT-RPA检测方法,该方法的特异性及灵敏性良好,且具有反应迅速、操作简单等优点。本研究为MHV快速检测方法的进一步研发奠定了基础。

摘要：用4株小鼠肝炎病毒(MHV1,MHV3,A59,JHM)分别感染DBT细胞,收获病毒,提取病毒RNA。根据病毒基因的特异性保守序列设计引物,在最佳条件下进行RT-PCR,建立了RT-PCR检测方法,即两步法和一步法,分别扩增出600bp,375bp的特异性核酸片段,其中,一步法检测MHV更快速、简便。

摘要：为获得小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)结构蛋白基因S1、S2、M及N,分别构建了4个重组质粒。依据GenBank公布的MHV A59毒株RNA全序列设计4对特异性引物,以A59 RNA反转录得到的cDNA为模板,通过PCR扩增出S1、S2、M及N这3个结构蛋白基因的4个片段,分别将其通过A-T连接入pMD-20 T载体后,双酶切鉴定正确后,送出测序确认。将测序结果与GenBank序列比对,确认扩增得到的S1、S2、M及N的核酸序列与其相似度分别为100%,99%,100%和99%。试验成功扩增出S1、S2、M及N的核酸序列,其构建的重组质粒可以作为检测MHV的阳性对照,为建立RT-PCR快速检测试验小鼠MHV的方法提供生物材料。

摘要：目的建立小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测技术并进行初步应用。方法针对MHV核衣壳蛋白基因序列设计6条特异性引物,以MHV基因组RNA为模板,进行RT-LAMP反应。扩增产物通过浊度、SYBR green I荧光染料显色及电泳三种方法观察结果。同时,用限制性内切酶AluI对扩增产物进行酶切鉴定。进行RT-LAMP特异性和敏感性试验。最后用建立的RT-LAMP方法检测55份小鼠临床样本。结果RT-LAMP技术简单快速,等温条件下(65℃)一个小时内即可完成反应。酶切结果证明RT-LAMP产物正确。该技术具有很高的特异性和敏感性,可检测到的MHV RNA最低浓度为0.1 pg/μL,比逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)灵敏10倍。临床样本检测结果显示,与RT-PCR比较RT-LAMP方法的敏感性和特异性分别为100%和83.3%。结论RT-LAMP技术是一种快速、简便诊断方法,该方法检测特异性强、敏感性高,可以成为快速准确检测MHV的有效手段。

摘要：目的对小鼠肝炎病毒(mouse hapetitis virus)A59毒株核蛋白(N)基因进行了克隆、表达和重组蛋白的免疫活性分析。方法根据GenBank公布的MHV-A59 N基因序列(AY700211),设计了一对特异性引物,通过RT-PCR扩增出N基因的主要抗原片段NS,将目的片段纯化后与pGEM-T-easy载体连接得到重组质粒pTN,双酶切回收目的基因片段克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组质粒pGEX-NS,转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行了诱导表达。对表达裂解物进行SDS-PAGE和Western-blotting验证。结果表达产物相对分子质量约56×103与预期相符;能与MHV阳性血清发生特异性反应,出现单一条带。结论原核表达的NP(S)蛋白有良好的抗原性,为检测小鼠肝炎病毒抗体的ELISA检测方法的研究奠定了基础。

摘要：根据GenBank公开序列自行设计一对引物,通过RT-PCR扩增出小鼠肝炎病毒的全长S1基因,并将其插入真核表达质粒pVAX1中,构建出重组真核表达质粒pVAX1-S1。将重组质粒转染COS-7细胞,采用间接免疫荧光检测出S1蛋白的体外表达。将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,构建出运送DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pVAX1-S1)。分别以5×108CFU、1×109CFU、2×109CFU剂量的重组菌口服接种6周龄BALB/c小鼠,试验结果表明,重组菌对小鼠具有良好的安全性。以1×109CFU剂量的重组菌口服免疫小鼠,抗体检测结果显示,在二免后两周和三免后两周,重组菌免疫组的血清抗体水平与SL7207(pVAX1)空载体免疫组间分别存在显著性差异(P<0.05)和极显著性差异(P<0.01)。在三免后两周重组菌免疫组出现了较高水平的肠黏膜抗体。

摘要：建立一种能对MHV1、MHV3、JHM、A59 4种常见小鼠肝炎病毒（Murine Hepatitis Virus,MHV）进行分型检测的SNa Pshot新方法。根据MHV 4种常见毒株基因序列比对结果,设计内外两对PCR通用引物和4个单碱基延伸引物,提取MHV 4种常见毒株RNA,逆转录后进行PCR扩增,纯化扩增产物,用SNa Pshot方法进行单碱基延伸,将产物进行毛细管凝胶电泳,根据电泳结果分析毒株基因型。优化SNa Pshot分析条件,进行灵敏度、特异性分析。用ELISA法和SNa Pshot方法检测41例小鼠（Mus musculus）血清样本,将阳性样本进行克隆测序检测。当T1-T4引物修饰的poly T的数量分别为0、3、10和15,其浓度比为4：6：5：10,引物大小分别为16 bp、19 bp、26 bp和31 bp时,SNa Phot分型检测MHV c DNA的最低浓度为1.25 mg/L,特异性为100%,与ELISA和T-克隆测序比较,其准确性为100%（41/41）,阳性样本均为JHM毒株。实验结果说明,所建立的SNa Pshot检测方法能对MHV1、MHV3、JHM、A59进行分型检测,并且具有灵敏、特异、准确的优点。

摘要：为满足口岸对入境噬齿类动物快速检疫的需要,建立小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus,MHV)快速核酸检测方法。方法使用引物和TaqMan荧光探针设计软件,针对MHV保守基因设计引物和探针,建立了RT-PCR和Real-time RT-PCR方法检测噬齿类动物临床样本中MHV的方法。结果本研究建立的RT-PCR和Real-time RTPCR检测MHV方法具有良好的特异性和敏感性,通过将建立的方法应用于MHV阳性鼠临床样品的检测,证实两种MHV核酸检测方法具有良好的稳定性。结论本研究建立的RT-PCR和Real-time RT-PCR检测MHV的方法,适用于动物粪便、尿液等易于获得样本的检测。

摘要：目的建立小鼠肝炎病毒(MHV)实时荧光定量PCR检测方法,并初步应用于实验裸鼹鼠等啮齿类动物的检测。方法选择MHV E基因保守区域设计合成特异性引物和探针,建立荧光定量PCR方法,并对方法特异度、敏感度、线性、重复性和稳定性进行方法学验证。同时用建立的方法对79只清洁级小鼠、35只SPF小鼠、63只裸鼹鼠、10只长爪沙鼠、20只金黄仓鼠和4只黄鼠进行MHV检测。结果成功建立了MHV实时荧光定量PCR方法;方法的线性范围为(1×10~1~1×10~9)拷贝/μL,与仙台(SV)病毒、呼肠孤病毒3型(Reo3)、小鼠肺炎病毒(PVM)、牛冠状病毒(BCV)均无交叉反应,方法的检测敏感度为10拷贝/μL。重复性和稳定性试验显示实验间变异系数均小于5%。检测结果显示63只裸鼹鼠、35只SPF小鼠、10只长爪沙鼠、20只金黄仓鼠和4只黄鼠均为阴性。79只清洁级小鼠MHV阳性率为22.78%。建立的方法与RT-PCR比较,可信度达97.47%。结论建立的MHV荧光定量PCR方法特异、敏感,能够对多种啮齿类动物体内携带的MHV进行检测。

摘要：目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小鼠肝炎病毒N基因. 方法 根据GenBank发表的小鼠肝炎病毒A59株N基因序列（AY700211）,设计一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增出N基因的ORF,将目的 片段克隆入pFastBacHTa中,构建重组转移载体pFastBHa-N.将重组质粒转化DH10Bac感受态细菌,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组穿梭载体Bacmid-N.通过脂质体将其转染昆虫细胞Sf9. 结果 获得了重组杆状病毒rBN,并通过Westernblot和IFA分析表明证实N蛋白在昆虫细胞中获得正确表达,且表达产物具有抗原性. 结论 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了小鼠肝炎病毒N蛋白,为进一步进行建立诊断学方法的研究奠定了基础.