摘要：t细胞是获得性抗肿瘤免疫的重要细胞亚群,但肿瘤组织中的t细胞数量少,且处于免疫抑制甚至耗竭状态,这是导致肿瘤免疫逃逸和免疫检查点抑制剂等抗肿瘤免疫治疗效果不佳的重要原因。过继性t细胞治疗主要包括肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltrating lymphocytes,tILs)、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t-cell,CAR-t)、t细胞受体工程化t细胞(t-cell receptor engineering t cell,tCR-t)治疗,其通过体外筛选扩增富集肿瘤特异性t细胞或通过基因改造赋予t细胞新的抗原特异性(CAR-t、tCR-t),有效克服了肿瘤浸润t细胞不足的缺陷。虽然过继性t细胞治疗在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的研究起步较晚,但已显示治疗的安全可行性和初步抗肿瘤效果,值得进一步深入研究。本文将对tILs、CARt、tCR-t的原理、培养方法、生物学特征以及在NSCLC治疗中的研究进展进行综述,以期为优化临床研究设计和开展新型NSCLC免疫治疗提供新思路。

摘要：多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是第二大最常见的血液系统恶性肿瘤,尽管现代疗法使患者症状得到了显著改善,整体生存率明显提高,但多数患者仍然复发并死亡。嵌合抗原受体t(chimeric antigen receptor t,CAR-t)细胞疗法在多种肿瘤治疗特别是血液系统肿瘤治疗中显示出明显疗效,为复发/难治性MM的治疗带来希望。本文主要从CAR-t细胞结构设计、活性优化、安全性控制等方面来阐述CAR-t细胞治疗MM的优化策略新进展。

摘要：目的构建一种逆转录病毒载体介导的SynNotch门控系统。方法对逆转录病毒载体进行设计改造,在其两端插入绝缘子序列(insulator),并基于Gal4/UAS基因表达调控系统进行SynNotch门控系统的构建。首先采用逆转录病毒载体分别构建仅含有Gal4-VP64融合蛋白转录调控元件的门控质粒以及含有UAS激活序列的效应质粒,效应质粒使用绿色荧光蛋白(EGFP)及荧光素酶(luciferase)作为报告基因,共分为6种,其中三种为正向序列设计,将UAS序列以及报告基因正向插入逆转录病毒载体中(5’~3’),分别包括正向无绝缘子、正向单绝缘子、正向双绝缘子;另三种为反向序列设计,将UAS序列以及报告基因反向插入逆转录病毒载体中(3’~5’),分别包括反向无绝缘子、反向单绝缘子、反向双绝缘子。测序成功的质粒进一步通过病毒包装制备病毒载体,包括门控载体和效应载体。PCR法检测逆转录病毒滴度。将病毒载体转导入293t细胞,效应载体单独转导的293t细胞作为未诱导组,门控载体与效应载体共转导的293t细胞作为诱导组,分别通过流式细胞术及荧光素酶化学发光实验检测两组报告基因的表达效率。结果逆病毒载体滴度均在107~108拷贝/mL之间,且不低于阳性对照。流式细胞术的检测结果显示,正向设计的三种效应载体在未诱导的情况下EGFP的表达效率分别为95.5%、69.7%、76.2%,诱导后EGFP的表达效率分别为99.9%、95.3%、97.1%。反向设计的三种效应载体在未诱导的情况下EGFP的表达效率分别为0.085%、0.610%、7.400%,诱导后EGFP的表达效率分别为59.900%、77.900%、89.500%。荧光素酶化学发光实验的检测结果显示,正向设计的三种效应载体在未诱导的情况下luciferase表达的荧光强度均在104以上,诱导后荧光强度均在105以上;反向设计的三种效应载体在未诱导的情况下luciferase表达的荧光强度均在3×103以下,诱导后荧光强度均在104以上,诱导前后荧光强度比较,P<0.01,其中反向双绝缘子设计诱导后荧光强度可达到105以上。结论成功构建了一种逆转录病毒载体介导的SynNotch门控系统。

摘要：免疫疗法在肿瘤治疗学领域的发展突飞猛进,已成为多种恶性肿瘤的潜在治疗方法。其中,过继性细胞疗法是肿瘤免疫疗法中研究的热点,尤其是嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor engineered tcells,CAR-t)疗法。受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(recombinant receptor tyrosine kinase like orphan receptor1,ROR1)重组蛋白是一类高表达于多种肿瘤细胞的膜受体蛋白,与肿瘤的发生、发展密切相关,是肿瘤免疫疗法的理想靶标。目前,靶向ROR1的CAR-t疗法日益兴起,已广泛应用于白血病、三阴性乳腺癌、肉瘤、卵巢癌、肺癌等多种肿瘤的免疫治疗。现拟通过对ROR1 CAR-t疗法在多种肿瘤中的研究进展进行综述,以期更全面地评估ROR1CAR-t疗法的实际疗效,同时为ROR1CAR-t的改善设计提供参考依据,以期进一步推动ROR1CAR-t疗法的临床应用。

摘要：胰腺癌肿瘤微环境在胰腺癌的发生发展中起重要作用,也是导致胰腺癌患者对放、化疗不敏感及预后效果差的主要原因。免疫治疗主要通过激活人体自身免疫系统来对抗肿瘤,是继手术及放、化疗之后又一重要的抗肿瘤手段。但是,由于胰腺癌特有的肿瘤微环境的存在,限制了免疫治疗的效果。因此,从胰腺癌肿瘤微环境出发,设计新的免疫治疗策略来克服胰腺癌肿瘤微环境的影响,或根据肿瘤特点采取联合治疗的策略,对于提高胰腺癌的疗效具有重要的意义。本文就胰腺癌的肿瘤微环境特点及对其进行免疫治疗策略的研究进展进行综述。

摘要：目的:构建靶向GPC3阳性肝癌细胞的嵌合抗原受体修饰t细胞[chimeric antigen receptor-modified t cell,CAR-t cell],并评估其对GPC3阳性肝癌细胞的杀伤效能。方法:选择偏爱密码子技术改造基因序列,以增强CAR分子表达效率,设计靶向GPC3抗原的CAR分子基因并构建携带GPC3-CAR基因的慢病毒表达载体p CDH-GPC3-CAR,感染t细胞;采用Western blotting、流式细胞术、实时细胞监测和ELISA技术分别检测GPC3-CAR分子在CAR-t细胞的表达、慢病毒感染t细胞效率、GPC3-CAR-t细胞对GPC3阳性肝癌细胞的杀伤活性和特异性。结果:双酶切p CDH-GPC3-CAR重组慢病毒质粒可见分子质量和GPC3-CAR分子一致的基因片段,成功构建p CDH-GPC3-CAR慢病毒质粒。约54.38%的GPC3-t细胞表达GPC3-CAR分子,称为GPC3-CAR-t细胞。GPC3-CAR-t细胞对GPC3阳性的肝癌细胞Huh-7比GPC3阴性的肝癌细胞SK-HEP-1具有更高效的杀伤能力[(78.96±4.76)%vs(6.87±3.15)%,P<0.01]。与GPC3阳性Huh-7肝癌细胞共培养的肝癌GPC3-CAR-t细胞分泌IFN-γ水平比Mock组高效[(21 371.4±1 808.3)vs(152.8±12.5)pg/ml,P<0.01],这可能是其高效杀伤肝癌细胞的机制之一。结论:靶向肝癌的GPC3-CAR-t细胞具有高效分泌IFN-γ细胞因子并特异高效杀伤GPC3阳性肝癌细胞的能力,为进一步推进GPC3-CAR-t临床前和临床研究奠定基础。

摘要：细胞治疗产品的制备分为载体物质制备和CAR-t细胞终产品制备两大部分,笔者阐述了其工艺平面,如房间布局和人流、物流等要求。重点以CAR-t细胞终产品为例,介绍了其工艺设备和厂房设施的设计要求。