摘要：为确定感染性克隆质粒免疫小鼠拯救获得的病毒量与诱导抗体之间的关系,以选择最佳免疫剂量,本研究建立了一种快速、灵敏的TaqMan荧光定量PCR检测方法。根据pcDNA3.1(+)-PCV1-2m-V5质粒的ORF2和V5标签序列设计特异性引物和探针,并将该质粒作为阳性标准品,优化荧光定量PCR条件后,按10倍倍比稀释,建立标准曲线,进行灵敏性、特异性和稳定性验证;而后,应用该方法对免疫不同质粒浓度的6组小鼠,分别在免疫后1~9周进行病毒血症检测;同时,应用ELISA方法分别对PCV2抗体滴度进行检测。结果表明,试验建立的荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性、特异性和稳定性,检测范围可达1.29×10^1~1.29×10^9拷贝/μL;病毒血症可持续至第5周,抗体可维持至第8周。通过分析抗体滴度变化与病毒载量消长关系,确定使用200μg作为小鼠的最佳免疫剂量。本试验为感染性克隆质粒进一步在本体动物(猪)体内评估免疫效果奠定基础。

摘要：为了明确我国犬瘟热病毒流行毒株的关键毒力基因及其致病机制,本研究构建了一株表达疫苗毒株H基因的嵌合犬瘟热病毒rHBF-vacH。犬瘟热病毒的囊膜蛋白H和F,决定着犬瘟热病毒宿主嗜性和致病性,也是产生免疫保护的关键抗原。因此,本研究以GenBank中公布的犬瘟热病毒疫苗毒株Onderstepoort序列(AF378705)为模板,利用Primer Premier 6.0设计特异性引物,扩增其H基因,将Onderstepoort的H基因定向克隆至pcDNA3.2-HBF-1中,筛选获得正确的全长重组质粒pcDNA3.2-HBF-vacH之后,通过病毒拯救,获得嵌合病毒rHBF-vacH,最后,通过免疫荧光、RT-PCR和电镜观察,初步鉴定嵌合病毒rHBF-vacH的基因组中携带有犬瘟热病毒疫苗毒Onderstepoort的H基因。本研究构建的嵌合病毒rHBF-vacH为国内犬瘟热病毒流行毒株H基因致病性研究提供了技术平台,有助于设计重组犬瘟热疫苗。