摘要：目的 应用小片段PCR产物对布鲁菌进行快速种属鉴定.方法 收集2008年1月至2009年6月在吉林省松原地区从92例布鲁菌病患者血液中分离出的布鲁菌13株,其中羊布鲁菌9株,牛布鲁菌2株,猪布鲁菌2株.根据布鲁菌属细菌重复插入序列IS711及羊布鲁菌、牛布鲁菌及猪布鲁菌种间特异性基因片段设计引物,对3株布鲁菌标准菌株及13株临床分离布鲁菌分别进行PCR反应,获得相应PCR产物.将PCR产物T-A克隆并进行测序分析.对布鲁菌标准菌株DNA模板进行稀释,对每一稀释度的DNA模板分别进行10次PCR扩增,进行灵敏度和稳定性检测.结果 4种PCR反应均可获得特异的小片段PCR产物,片段长度分别为63、67、81和83 bp,T-A克隆测序结果 与目的 基因片段比较,符合率为100%,检测模板的最低DNA浓度为1 μg/L,分别用不同的引物对相应布鲁菌DNA模板进行10次PCR扩增,均得到预期结果 .结论 本研究建立的PCR反应能鉴定布鲁菌种属,具有良好的特异性、灵敏度和稳定性.

摘要：目的 建立一种能快速检测布鲁菌的实时荧光定量PCR(RT-PCR)初步筛查方法。 方法 根据编码布鲁菌外膜蛋白omp10和omp31的碱基序列设计4对引物和对应探针,即omp10、omp10-1、omp31和omp31-1,应用实时荧光定量PCR技术,将设计的引物和探针分别用于检测6个种类的19份已知生物型的标准布鲁菌株DNA、10份云南玉溪分离的布鲁菌株DNA和224份阴性对照菌株DNA,包括35份巴尔通体菌、103份小肠结肠炎耶尔森菌(其中包括4份O∶3型和9份O∶9型)和86份杂菌,根据检测结果评价引物和探针的特异性。 结果 omp10、omp10-1可对19种标准布鲁菌株DNA进行扩增,omp10的起峰时间和扩增曲线优于omp10-1,且omp10不能扩增阴性布鲁菌株的DNA;omp31-1可对16种标准布鲁菌株DNA进行扩增;omp31不能扩增标准布鲁菌株DNA。omp10、omp10-1和omp31-1检测10份玉溪分离的布鲁菌株,DNA的平均循环(Ct)值分别为:19.87,、19.14、17.52。 结论 omp10特异性强,只对布鲁菌有特异性扩增,可用于布鲁菌的快速检测。

摘要：目的建立快速鉴别羊种布鲁菌1、2、3型的基因分型方法。方法根据羊种布鲁菌标准参考菌株16MRpoB基因的单核苷酸多态性和羊种布鲁菌基因组中串联重复序列（tandem repeat sequence，TRS）Bin42基因的差异，分别设计引物．建立鉴别羊种布鲁菌标准参考菌株的***和TRS-PCR方法．用建立的方法对临床分离的羊种布鲁菌进行鉴别。并与常规生物分型方法进行比较。结果RpoB-PCR和TRS-PCR对羊种布鲁菌标准参考菌株（生物型1、2、3型）的鉴定结果与常规鉴定方法结果一致。51株临床分离羊种布鲁菌，RpoB—PCR的鉴别结果显示，50株[包括1（17株）、2（3株）、3（30株）生物型]羊种菌均鉴别为RpoB-2基因型，仅1株羊种1型菌鉴别为RpoB-3基因型。生物型相同的标准参考菌株与临床分离菌株，基因型鉴定结果不完全一致。TRS-PCR的鉴别结果显示，51株羊种菌均鉴别为羊种2型布鲁菌（TRS-2基因型）。结论羊种布鲁菌生物型与基因型未见明显关联．羊种布鲁菌分离株与标准参考菌株的RpoB基因存在显著差异，Bru42不能用于临床分离羊种布鲁菌的基因分型。

摘要：目的初步探究布鲁氏菌外膜蛋白16、19脂化型重组蛋白(L16、L19)对人单核细胞白血病细胞系(THP-1细胞)免疫调控因子表达的影响。方法以佛波酯(PMA)活化的THP-1细胞为体外实验细胞模型,采用成组设计,分别将L16、L19与THP-1细胞共培养(L16刺激组、L19刺激组),并以PMA活化的THP-1细胞为对照组。共培养4 h时,分别采用免疫荧光染色(IFS)法和蛋白免疫印迹(Western blot)法检测L16、L19是否进入细胞。共培养12、24 h时,实时荧光定量PCR法测定干扰素调节因子1(IRF-1)、Ⅱ类主要组织相容性复合物反式激活蛋白(CⅡTA)mRNA表达水平;Western blot法检测T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(Tim-3)和γ干扰素受体1(IFNGR1)蛋白表达水平。结果共培养4 h时,可见L16、L19分别进入L16、L19刺激组THP-1细胞内。共培养12 h时,L16刺激组IRF-1 mRNA表达水平(0.16±0.15)明显低于对照组(1.00±0.00,P0.05)。Western blot结果显示,共培养12、24 h时,对照组、L16刺激组、L19刺激组INFGR1、Tim-3蛋白表达水平比较,差异均有统计学意义(F=50.92、6.80、148.73、156.57,均P<0.05)。其中,共培养12 h时,L16、L19刺激组INFGR1蛋白表达水平均明显低于对照组,且L19刺激组高于L16刺激组(均P<0.05);而L19刺激组Tim-3蛋白表达水平高于对照组(P<0.05)。共培养24 h时,L16、L19刺激组INFGR1蛋白表达水平均低于对照组,且L19刺激组高于L16刺激组(均P<0.05);而L16刺激组Tim-3蛋白表达水平高于对照组和L19刺激组(均P<0.05)。结论布鲁氏菌L16可以下调THP-1细胞IRF-1、CⅡTA mRNA表达水平;L16、L19均能够下调IFNGR1、上调Tim-3蛋白表达水平。

摘要：目的建立实时荧光定量PCR方法检测布鲁氏菌基因组内IS711转座酶基因(orfA基因)的拷贝数,并应用于布鲁氏菌种与生物型的鉴定。方法构建基于Taqman探针法实时荧光定量PCR技术的orfA基因拷贝数的检测体系。设计bcsp31基因和orfA基因的引物和探针,应用实时荧光定量PCR方法同时检测同一菌株相同DNA浓度下的bcsp31基因和orfA基因含量,获得2个基因的循环数(CT值),再根据bcsp31基因和orfA基因CT值的差异,换算出待检测布鲁氏菌菌株基因组内orfA基因的拷贝数。同时,将布鲁氏菌16M菌株DNA进行2倍递减稀释,验证检测体系的稳定性。结果当16M菌株DNA浓度相差2倍时,实时荧光定量PCR方法同时检测bcsp31基因和orfA基因,测得的CT值差值均值均为1.00,95%置信区间为0.95~1.05,标准差为0.17,变异系数为0.17。应用该检测体系检测30株布鲁氏菌菌株DNA中orfA基因的拷贝数,发现羊种生物1~3型菌株分别有6、9和7个拷贝数;猪种生物2型菌株有10个拷贝数,与其他4个猪种生物型(1、3~5)菌株拷贝数不同;绵羊附睾种菌株有37个拷贝数;8个牛种生物型(1~7、9)菌株拷贝数稳定在5~6个。结论成功建立了一种检测布鲁氏菌orfA基因拷贝数的实时荧光定量PCR方法,该方法能够鉴定部分布鲁氏菌种与生物型菌株。

摘要：目的观察布鲁菌外膜蛋白(OMP)16脂化型(L16)和非脂化型(U16)对成骨细胞的毒力效应。方法利用大肠埃希菌BL21(DE3)原核表达系统制备L16和U16重组蛋白,并使用镍柱纯化。采用成组设计,利用小鼠成骨细胞系(MC3T3细胞)分别与L16和U16重组蛋白共孵育(L16、U16刺激组),以布鲁菌脂多糖(LPS)刺激物为阳性对照(LPS对照组),未加任何刺激的细胞作为阴性对照,孵育时间为24 h。CCK-8法检测MC3T3细胞的活力;离心收集培养细胞上清,生物发光法测定上清中乳酸脱氢酶(LDH)的释放率,评价L16和U16对MC3T3细胞的毒力作用;进一步使用AnnexinⅤ-PE/7-AAD双染流式细胞术检测MC3T3细胞的凋亡率,以及通过免疫印迹法(WB)检测凋亡执行蛋白Caspase-3的活化水平。结果L16刺激组细胞活力[(56.16±1.63)%]显著低于U16刺激组和LPS对照组[(97.02±1.44)%、(98.64±0.90)%,P均<0.01],LDH释放率[(84.64±0.96)%]显著高于U16刺激组和LPS对照组[(34.82±3.41)%、(26.75±1.95)%,P均<0.01]。AnnexinⅤ-PE/7-AAD染色结果显示,L16刺激组细胞凋亡率为(46.45±2.19)%,而其余组均<1%。WB结果显示,L16刺激组细胞内存在活化的Caspase-3,而U16刺激组和LPS对照组未检测到此活化片段。结论L16能诱导成骨细胞的凋亡,使成骨细胞的增殖受到抑制,而U16的作用不明显,具备完整脂化结构的布鲁菌L16是毒力效应所必需的。