摘要：帕利亚姆血清群病毒(PALV)在我国广泛流行,给我国牛羊养殖业健康发展构成了严重威胁,目前国内尚无PALV核酸检测方法的报道。本研究根据流行于我国的中山病毒(CHUV)、Bunyip Creek virus(BCV)和D’Aguilar virus(DAV)3种血清型PALV的Seg-7保守基因序列,设计针对PALV的群特异性RT-PCR扩增引物,通过反应条件优化,建立了PALV的一步法RT-PCR检测方法,其最佳引物浓度为0.8μmol/L;最佳退火温度为56℃。对该方法进行特异性试验,结果显示该方法可特异性的检测出CHUV、BCV和DAV核酸,而对环状病毒属的蓝舌病病毒、流行性出血病病毒、非洲马瘟病毒和广西环状病毒的检测结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对RNA标准品的最低检测限为6.9×10~1拷贝/μL。利用该方法检测血液样品,结果显示该方法检测结果与病毒分离结果基本一致。本研究建立的PALV一步法RT-PCR方法具有特异性强、敏感度高等优点,为开展PALV感染疫病诊断与流行病学研究提供了技术保障。

摘要：【目的】建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)及帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)快速筛查和诊断的三重RT-qPCR检测技术。【方法】选择BTV的NS3、EHDV的NS1以及PALV的VP7基因作为靶基因,设计3组特异性引物和探针,建立3种病毒的三重RT-qPCR检测方法。对检测方法的灵敏度、特异性和重复性进行验证,同时使用我国分离的BTV、EHDV与PALV不同血清型毒株和对应的阳性血液样本,与24个BTV血清型及6个EHDV血清型参考毒株对该三重法的检测效果进行验证。【结果】三重RT-qPCR的扩增效率均可达90%以上,对3种病毒核酸拷贝数的检测下限均为10μL-1级别,与单重法的检测灵敏度相当;与阿卡斑病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒和牛流行热病毒之间无交叉反应;Ct值批内、批间变异系数均在2%以内;可检测出24种BTV血清型、6种EHDV血清型与3种PALV血清型,具有群特异性;可有效检测血液中的病毒核酸,检测结果与单重法一致。【结论】本研究建立的BTV、EHDV与PALV三重RT-qPCR具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于临床样本中对3种病毒的同时诊断与筛查。

摘要：为掌握云南地区帕利亚姆血清群病毒(PALV)的分布情况和遗传特性,本研究分别在云南省师宗、江城及芒市设立监控点,通过定期采集哨兵动物抗凝血以“C6/36细胞-BHK细胞”的接种方式分离病毒,通过提取病毒RNA进行RT-PCR以鉴定病毒血清型,通过设计特异性引物对分离株Seg-2、Seg-3、Seg-7进行克隆及测序比对以分析其遗传特性。结果显示,从2017年云南省师宗县样品中获得5株阳性分离物,其中Chuzan virus(CHUV)2株,D’Aguilar virus(DAV)1株,Bluetongue virus(BTV)2株,经病毒序列结果比对和进化分析,2株CHUV的Seg-2和Seg-3与中国分离株独立成一簇,体现出明显的地域性,而2株CHUV的Seg-7相似度>99%,与云南、广西、台湾PALV具有相近的亲缘关系。分离株DAV的Seg-2独立成为一支,与非洲毒株亲缘关系最近,其Seg-3和Seg-7则相对保守,3株PALV分离株的Seg-3在系统发生树上划分为“东方型”地域型。研究结果为进一步开展PALV的感染特性、流行病学与疫苗研究奠定基础。