摘要：根据柑桔衰退病毒(CTV)P20基因序列设计cquctv9/cquctv10特异引物对,以柑桔RNApolymeraseⅡ基因作为内参照,建立了柑桔衰退病的常规rt-pcr快速检测体系;依据柑桔衰退病毒P20基因序列设计cquctv1/cquctv2特异引物对和TaqMan探针cquctvp1,建立了柑桔衰退病荧光定量rt-pcr快速检测体系。常规rt-pcr检测下限是含有CTV的50pg总RNA,荧光定量rt-pcr法的检测下限是2fg纯CTV片段。荧光定量rt-pcr的灵敏度相对比常规rt-pcr高100倍。利用常规rt-pcr和荧光定量rt-pcr体系对从2005年3月到2006年7月采自田间的样品进行检测,结果表明,2种检测体系都有很好的特异性和准确性;对183个田间柑桔苗木样品带毒率检测结果表明,荧光定量rt-pcr检出率为(82.5%),比常规rt-pcr检出率(73.2%)高。

摘要：为建立西藏环状病毒(TIBOV)群特异性核酸检测方法,本研究根据云南师宗新分离的TIBOV(YNSZ/V290/2019)毒株和GenBank中登录的TIBOV毒株VP6基因序列的保守区,设计并合成特异性引物和探针,建立了荧光定量rt-pcr和常规rt-pcr检测方法,并分别进行了特异性、灵敏性和临床样品的检测。试验结果表明,两种检测方法均可特异性地扩增TIBOV及检出特异荧光信号,而对帕利亚姆血清群病毒(PALV)、蓝舌病病毒(BTV)、流行性出血病病毒(EHDV)、广西环状病毒(GXOV)、阿卡斑病毒(AKAV)、云南环状病毒(YNOV)、非洲马瘟病毒(AHSV)和牛流行热病毒(BEFV)无扩增和无有效荧光信号检出,具有较好的特异性。灵敏性试验结果显示,荧光定量rt-pcr检测TIBOV核酸的下限可达10 copies/μL,常规rt-pcr的检测下限为10~2copies/μL。临床样品检测显示,两种方法均能检测出库蠓样品中的TIBOV核酸,常规rt-pcr扩增产物经测序和BLAST比对分析显示,库蠓样品中检测到的TIBOV与NCBI数据库中TIBOV(DH13C120、XZ0906、D181/2008)毒株VP6基因序列相似度均在95%以上。荧光定量rt-pcr因其更高的灵敏度和实效性,能用于大量临床样品的快速检测,而常规rt-pcr可以对扩增产物进行胶回收测序,进一步了解待测病毒的遗传信息。两种方法相互辅助,可以为TIBOV的早期诊断、快速检测、流行病学调查和实验研究等提供有效的技术方法。

摘要：根据文献报道和GenBank已登录序列设计引物建立了葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)SYBRGreenⅠ染料法实时荧光定量rt-pcr检测技术体系。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好线性关系,扩增效率为99.2%,决定系数为0.999,可特异性检测GVA,灵敏度高(达常规rt-pcr的100倍),重复性好。对不同季节、不同品种以及不同部位葡萄样品(嫩叶、嫩叶柄、老叶、老叶柄、卷须和休眠枝条)中GVA的检出率普遍高于常规rt-pcr。不同季节间比较,对秋、冬季样品检测效果最好,除嫩叶外其余部位检出率均达100%,春夏季检出率为10%～100%。不同部位间比较,老叶柄和休眠枝条检测效果最好,检出率均达100%,其次为老叶(80%～100%),其余部位样品检出率为10%～100%。在大量田间样品检测中,休眠枝条样品检测结果与常规rt-pcr一致,而秋季老叶柄样品检出率明显高于常规rt-pcr。

摘要：鸡传染性法氏囊病(IBD)是危害我国养禽业的主要疫病之一,呈世界性分布,对养鸡业造成重大危害。在国际种禽贸易中,对IBDV检测是口岸检疫的主要对象之一。为了建立标准的鸡传染性法氏囊病病毒分子检测方法,采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的带有通用引物和酶切位点的特异性引物,通过对6株不同毒株的反复试验,优化了针对A片段VP2基因的常规反转录-聚合酶链反应(rt-pcr)检测方法 (IBDV-VP2(604)-rt-pcr)和针对B片段VP1基因的rt-pcr检测方法(IBDV-VP1(642)-rt-pcr);针对A片段VP2基因设计特异性引物和探针,建立了优化IBDV特异性实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(rrt-pcr)检测方法(IBDV-VP2-rrt-pcr)。将传染性法氏囊病疫苗-法倍灵(IBDV-BLEN)疫苗株进行系列稀释,两种rt-pcr检测方法的灵敏度均为10-3,而IBDV-VP2-rrt-pcr检测方法灵敏度为10-4。所建立的三种分子生物学检测方法特异,与其他家禽病毒无任何交叉反应。通过对自2007年以来18批221份田间样品检测表明,所建立的方法准确可靠,适合对鸡传染性法氏囊病病毒进行快速灵敏检测和监测。