摘要：目的利用干扰rna技术构建线粒体加工肽酶(mitochondrial processing peptidases,MPPs)干扰rna真核表达载体,探讨MPPs在神经细胞中的作用,为帕金森病的研究提供有价值的资料。方法(1)根据Gen-Bank提供的大鼠MPPsα亚基(peptidase mitochondrial processing alpha,Pmpca)序列,设计并合成4对MPPs干扰rna单链寡核苷酸:MPPs-SR-1113,MPPs-SR-1425,MPPs-SR-561,MPPs-SR-903。(2)使互补的单链寡核苷酸模板退火,再转化为能表达其小发卡结构rna的DNA序列。(3)使PGPU6/GFP/Neo载体的线性化。(4)shrna与载体的连接。(5)酶切鉴定并测序鉴定结果。结果(1)酶切结果表明,所有质粒均为阳性重组载体。(2)经鉴定证实,构建的sirnas序列与基因库中序列完全相同,并且未发现有突变、缺失、插入等异常存在。结论利用干扰rna技术可成功构建MPPs干扰rna真核表达载体。

摘要：目的设计针对H5N1高致病性禽流感病毒(HPAIV)核蛋白(NP)基因的干扰rna(sirna),研究其在细胞水平抑制病毒复制的效果。方法根据sirna设计原则,设计并合成3对靶向HPAIV NP基因的sirna,构建表达性质粒(ps-NP732、ps-NP863、ps-NP1344),分别转染MDCK细胞并攻毒,通过病毒滴度测定r、eal-time PCR、间接免疫荧光试验和Western blot,检测sirna抑制AIV复制的效果。结果设计的3对sirna中,ps-NP863明显抑制AIV复制,病毒滴度与对照组相比降低31倍,real-time PCR、间接免疫荧光试验、Western blot结果与病毒滴度测定结果相符,而ps-NP732和ps-NP1344无抑制AIV复制作用。结论构建的ps-NP863可显著抑制HPAIV复制,为开发抗AIV治疗制剂和动物机体抗AIV研究奠定了基础。

摘要：目的构建Nogo受体基因干扰rna表达载体,为促进中枢神经轴突的再生、探索临床治疗脊髓损伤新途径奠定基础。方法GeneBank中NgR的序列,应用***网站的设计软件设计、合成NgR mirna的相应Oligo DNA,与BLOCK-iT Poll miR rnai Expression Vector相连接,转化感受态*** TOP10。结果限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切、测序鉴定重组载体BLOCK-iT Poll miR rnai/NgR,显示NgR mirna相应的Oligo正确克隆入BLOCK-iTPoll miR rnai Expression Vector。结论成功构建Nogo受体基因干扰rna表达载体。

摘要：目的:构建CDK2的干扰rna真核表达载体,并且稳定转染人脑胶质细胞瘤SHG44细胞来抑制CDK2的表达,为人脑胶质细胞瘤的研究提供有价值的资料。方法:1.根据sirna设计原则和GeneBank数据库中CDK2的cDNA序列,构建CDK2干扰rna真核表达载体PGenesil-1-CDK2,并测序鉴定。2.利用脂质体法转染CDK2的干扰rna真核表达载体,G418筛选阳性转染细胞克隆,制备稳定转染干扰rna真核表达载体的SHG44细胞系,用倒置荧光显微镜观察荧光蛋白表达量。结果:1.成功构建了CDK2干扰rna真核表达载体。经鉴定证实,构建的sirnas序列与基因库中序列完全相同,并且未发现有突变、缺失、插入等异常存在。2.获得稳定转染CDK2干扰rna真核表达载体的SHG44细胞系,命名为PGenesil-1-CDK2-SHG44。结论:成功的建立稳定转染CDK2干扰rna的SHG44细胞系。

摘要：目的:构建KCTD10干扰rna慢病毒载体。方法:合成KCTD10干扰序列,构建GV248-KCTD10-rnai慢病毒干扰载体,利用PCR与测序验证阳性克隆。将KCTD10 sirna干扰病毒载体与质粒pHelper1.0和质粒pHelper2.0三个载体共同转染293T细胞,使细胞合成并分泌释放病毒颗粒。收集病毒颗粒并检测病毒滴度。结果:GV248-KCTD10-rnai慢病毒载体成功被连接转化,测序结果与设计序列一致;共转后收获KCTD10 sirna慢病毒颗粒,检测其滴度为5×10~8TU/mL。结论:成功包装了KCTD10 sirna慢病毒颗粒,为后续进一步研究KCTD10基因在糖尿病视网膜病变中的作用奠定了基础。

摘要：目的探讨rna干扰技术在体外抑制人巨细胞病毒(HCMV)基因表达时sirna转染和病毒感染的先后顺序对抑制效果的影响。方法设计并化学合成靶向即刻早期(IE)基因的sirna。应用阳离子脂质体法将sirna导入人胚肺成纤维(HELF)细胞,并分为先转染sirna后感染HCMV、先感染HCMV后转染sirna以及同时转染sirna和感染HCMV3组,同时设置正常对照组、阴性对照组、阳性对照组和转染试剂对照组。采用荧光定量PCR和琼脂糖凝胶电泳方法分别检测分析各组转染的sirna对IE基因和阳性对照基因GAPDH的抑制效果。结果阳性对照组GAPDH基因mrna表达量较阴性对照组和转染试剂对照组有明显下降,sirna抑制率为70.4%,差异有统计学意义(P<0.05)。先转染si rna后感染HCMV组、先感染HCMV后转染si rna组、同时转染sirna和感染HCMV组以及阳性、阴性、转染试剂对照组的IE基因m rna表达量比较,差异有统计学意义(F=146.93,P=0.000)。其中先转染sirna后感染HCMV组以及同时转染si rna和感染HCMV组对IE基因m rna表达的抑制效果均好于先感染HCMV后转染sirna组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在体外,sirna能有效抑制靶基因的表达,且先转染si rna再感染病毒的抑制效果相对更好,提示sirna对HCMV感染具有一定的预防作用。

摘要：目的构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和rna干扰质粒,为进一步探究rna干扰技术对CaSR在肾脏对钙重吸收调控中的作用提供基础准备。方法(1)CaSR基因慢病毒高表达细胞系构建:PCR克隆CaSR目的基因,双酶切CaSR基因和pcDNA3.1载体,连接酶连接,阳性克隆筛选后测序,将pcDNA3.1-CaSR高表达载体和空载体(对照组)经慢病毒包装后转染NRK-52E细胞,Western blot测定CaSR蛋白表达;(2)CaSR基因的rna干扰质粒构建:设计3对靶向干扰CaSR基因的rna引物序列,双酶切干扰引物和pLV[shrna]-EGFP载体,然后经T4连接酶连接,获得重组干扰质粒pLV[shrna]-EGFP-CaSR,转化至感受态*** DH5,阳性克隆筛选后测序,测定干扰效率。结果(1)测序结果与CaSR基因序列一致;(2)测序结果与设计shrna引物序列一致;(3)Western blot检测获得慢病毒高表达稳定细胞系的CaSR蛋白;(4)干扰质粒干扰高表达细胞系有效。结论成功构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和rna干扰质粒。

摘要：目的 :构建GAS41-shrna慢病毒载体。方法 :合成GAS41干扰序列,构建GV118-GAS41-rnai慢病毒干扰载体,连同包装质粒p Helper1.0和包膜质粒p Helper2.0共同转染293T细胞,收集储存病毒颗粒并进行滴度测定。结果 :构建的GAS41干扰慢病毒载体GV118-GAS41-rnai经PCR和测序鉴定,结果与设计序列相符,收获病毒颗粒,测定滴度为5×108TU/m L。结论 :成功构建了GAS41-shrna慢病毒载体,为后续进一步研究GAS41基因在视神经胶质瘤(optic nerve glioma,ONG)中的作用奠定了基础。

摘要：目的:探讨舒尼替尼诱导人肝癌HepG2细胞表达的自然杀伤细胞2族成员D配体(natural killer group 2 member D ligands,NKG2DLs)与核因子kappa B(nuclear factor B kappa,NF-κB)信号通路之间的相互作用。方法:常规体外培养HepG2细胞,利用实时荧光定量PCR检测1μmol/L舒尼替尼处理HepG2细胞24 h前后NF-κB基因家族成员mrna的表达情况,利用计算机辅助设计并合成NF-κB1、NF-κB2和Rel B sirna引物,通过脂质体法将目的基因sirna转染于HepG2细胞,荧光显微镜观察转染情况,实时荧光定量PCR检测干扰效率,Western blotting检测sirna转染前后He G2细胞内NF-κB1、NF-κB2和Rel B蛋白表达,流式细胞术检测sirna前后HepG2细胞NKG2DLs表达率。结果:实时荧光定量PCR结果显示,舒尼替尼处理HepG2细胞后,NF-κB1、NF-κB2和Rel B mrna表达水平升高,主要以NF-κB2 mrna和Rel B mrna升高为主。荧光显微镜观测sirna转染后HepG2细胞红色荧光表达率约为60%,干扰效率达95%以上。sirna转染后HepG2细胞内NF-κB1、NF-κB2和Rel B蛋白表达水平明显下降,sirna转染+药物组NKG2DLs表达率明显低于药物处理组(P<0.05)。结论:首次揭示了舒尼替尼通过NF-κB旁路途径诱导肿瘤细胞表达NKG2DLs。

摘要：针对H5N1高致病性禽流感病毒PB-1基因,通过rna干扰技术,设计sirna,研究其抑制病毒复制的效果.sirna转染MDCK细胞并接毒后,病毒滴度测定、Real-time PCR和间接免疫荧光试验结果显示,所设计的sirna(ps-PB1-777)具有明显的抑制病毒复制的效果,PB-1基因的拷贝数和病毒蛋白表达都下降.设计的sirna可显著抑制高致病性禽流感病毒的复制.因此,本研究中PB-1基因的有效sirna可为预防和治疗H5N1高致病性禽流感提供合理的技术支持和物质储备.