摘要：背景:骨髓间质干细胞体内、外均能分化为心肌细胞,但数量少且定向分化率较低。目的:探讨干细胞因子促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的作用。设计:开放性实验。单位:咸宁学院心血管疾病研究所,华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科。材料:实验于2003-10/2004-08在咸宁学院心血管疾病研究所实验中心完成。选取出生1～2d的SD新生大鼠20只,用于心肌细胞的培养。另选取清洁级成年SD大鼠25只,随机数字表法分为干细胞因子组、空白对照组,12只/组,剩余1只大鼠用于骨髓间充质干细胞的提取、培养及纯化。方法:①在共培养前用4,6-联脒-2-苯基吲哚标记骨髓间充质干细胞。干细胞因子组对大鼠进行体内动员,连续5d皮下注射重组鼠干细胞因子,20μg/(kg·d),然后提取其骨髓间充质干细胞于心肌细胞培养第3天进行共培养。空白对照组皮下注射相等剂量的生理盐水,未施加任何干预的骨髓间充质干细胞于心肌细胞培养第3天进行共培养。②用数码显微摄像及免疫荧光技术分别记录和检测MHCα/β、肌钙蛋白T的表达,测定4,6-联脒-2-苯基吲哚-骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的百分率。主要观察指标:①骨髓间充质干细胞生长情况。②检测4,6-联脒-2-苯基吲哚对骨髓间充质干细胞的核标记率。③拟做共培养的心肌细胞活力、纯度分析。④共培养后骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化情况。结果:①骨髓细胞悬液接种于塑料培养皿,细胞呈圆形散在分布于瓶底,24h换液后可见稀少的长梭形贴壁细胞,4d后梭形贴壁细胞开始增多,进入对数增长期,8～12d达到80%的融合。传代细胞增殖更加迅速,随着换液与传代,骨髓间充质干细胞逐渐得到纯化。②4,6-联脒-2-苯基吲哚对骨髓间充质干细胞的胞核标记率为100%。③心肌细胞体外培养第3天,搏动细胞的百分比为63%,搏动频率40～60次/min。免疫细胞化学技术检测肌钙蛋白T表达的阳性细胞百分比为75%。④在共培养的第2,3天,干细胞因子组4,6-联脒-2-苯基吲哚-骨髓间充质干细胞表达MHCα/β的阳性百分率均显著高于空白对照组(P<0.01);在共培养的第3,4,5天,干细胞因子组4,6-联脒-2-苯基吲哚-骨髓间充质干细胞表达肌钙蛋白T的阳性百分率亦均显著高于空白对照组(P<0.01)。结论:干细胞因子对骨髓间充质干细胞具有明显的促增殖分化作用。

摘要：背景:课题组在前期研究中发现银屑病患者骨髓造血细胞活性存在异常。目的:观察银屑病患者骨髓基质细胞分泌干细胞因子和粒细胞集落刺激因子的水平。设计、时间及地点:病例-对照观察,于2007-10/2008-08在太原市中心医院皮肤科实验室完成。对象:选择太原市中心医院皮肤科临床及病理确诊为寻常型银屑病的门诊患者24例,男16例,女8例;年龄16～59岁;另取血液科骨穿后经筛选的正常骨髓20例作为对照组,性别、年龄与银屑病患者匹配。方法:采用密度梯度离心法分离银屑病患者与对照组骨髓单一核细胞,通过贴壁法培养骨髓基质细胞,收集传了3代后又培养72h的骨髓基质细胞及培养上清。主要观察指标:流式细胞仪检测细胞表面标志并用ELISA法检测上清液中干细胞因子和粒细胞集落刺激因子的水平。结果:流式细胞仪检测结果显示,90%以上细胞表面抗原高表达CD29,而CD34、CD45及HLA-DR表达阴性,即骨髓基质细胞纯度在90%以上。银屑病组骨髓基质细胞培养上清液的干细胞因子和粒细胞集落刺激因子表达均显著高于对照组(P<0.01)。结论:银屑病患者骨髓基质细胞分泌干细胞因子和粒细胞集落刺激因子存在异常,提示银屑病患者骨髓造血微环境发生了改变。

摘要：目的:获得重组人干细胞因子／血小板生成素(SCF-TPO)融合蛋白的高表达,预测该全新型融合蛋 白的蛋白质结构。方法:设计引物,利用RT-PCR从胎肝细胞中扩增SCF和TPO氨基端功能区片段,采用基因融合 新策略将其融合成SCF-TPO融合基因,构建pET32a／SCF-TPO融合基因重组表达载体,在*** BL21(DE3)plysS 中获得正确高表达,采用生物信息学方法对融合蛋白的结构特征进行模拟分析。结果:首次成功构建了pEF32a／SCF -TPO原核表达载体,并获得了融合蛋白的高表达,表达量高达40％,主要以包涵体形式表达。蛋白结构预测结果 显示,融合蛋白的等电点、抗原性及亲水性无显著改变,接头序列具有高柔性。融合蛋白除一级结构有4个氨基酸发 生改变外,原来的α螺旋和β片层无改变。结论:获得了SCF-TPO融合蛋白的高表达,结构预测融合蛋白的设计符 合要求。为进一步研究SCF-TPO融合蛋白的生物学特性奠定了基础。

摘要：背景:骨髓干细胞动员以其无创伤、无免疫排斥反应,不需要干细胞提取、培养、扩增等工作倍受青睐。目的:观察联合应用粒细胞集落刺激因子和干细胞因子对大鼠急性心肌梗死的治疗作用。设计:随机对照观察。单位:锦州医学院药理教研室实验室。材料:选用32只成年雄性SD大鼠,体质量(200±20)g,购自锦州医学院实验动物中心。重组人粒细胞集落刺激因子(北京双鹭制药),重组人干细胞因子(成都地奥有限公司)。方法:实验于2005-07/11在锦州医学院药理教研室实验室进行。①5mg/kg盐酸异丙基肾上腺素左下腹腔注射复制急性心肌梗死模型,3h后将大鼠随机分为4组,每组8只。综合治疗组:用生理盐水稀释浓度至10mg/L的重组人粒细胞集落刺激因子1mL/kg和重组人干细胞因子1mL/kg皮下注射,连续5d。粒细胞集落刺激因子组:单用生理盐水稀释浓度至10mg/L的rhG-CSF1mL/kg皮下注射,每只大鼠和综合治疗组大鼠注射药品差量用生理盐水(1mL/kg)补足,连续5d。干细胞因子组:单用生理盐水稀释浓度至10mg/L的人干细胞因子1mL/kg皮下注射,每只大鼠和综合治疗组大鼠注射药品差量用生理盐水(1mL/kg)补足,连续5d。对照组:单用生理盐水(2mL/kg)皮下注射。②分别于造模后第14d和28d,摸球法从每组大鼠中抽取4只麻醉,自左心室心尖部插入内充肝素钠的塑料管至左心腔,用Medlab-u18c生物信号采集处理系统描记左心室峰压,左心室舒张末压,左室内压最大上升/下降速度,并同步记录心率。拔出气管插管,立即剪掉心脏,剪掉心房及右心室,微量天平称重,计算左心室质量/体质量,评估心肌重塑情况,将组织块切片,光镜下观测大鼠心肌病理形态及梗死面积。采用细胞图像分析仪病理图文分析每组大鼠心肌梗死面积。主要观察指标:各组大鼠左心功能指标、心肌梗死面积、心率和心室重塑情况及大鼠心肌病理形态。结果:纳入大鼠32只全部进入结果分析,无脱落。①大鼠左心功能指标比较结果:综合治疗组大鼠造模14,28d后左心室收缩压、左心室舒张末压、左心室内压最大上升/下降速度高于其他3组,造模28d时上述各指标均高于14d,差异有统计学意义(P<0.05),粒细胞集落刺激因子组两时间点上述指标均大于干细胞因子组及对照组(P<0.05)。②大鼠两时间点心肌梗死面积、心率和心室重塑情况:综合治疗组大鼠造模14,28d后心肌梗死面积及左心室重量小于其他3组,造模后28d心肌梗死面积小于14d(P<0.05),粒细胞集落刺激因子组两时间点上述指标均小于干细胞因子组与对照组。③大鼠心肌病理形态改变:造模后14及28d,综合治疗组和粒细胞集落刺激因子组均未见明显心肌瘢痕组织,有新生毛细血管生长,粒细胞集落刺激因子组毛细血管密度小于综合治疗组,均有成纤维细胞浸润。干细胞因子组和对照组可见瘢痕组织呈散在的灶性分布,有成堆或散在分布的淋巴细胞,其核小、深染、胞浆少,细胞间胞浆融合,新生肉芽组织增生不明显。结论:粒细胞集落刺激因子和干细胞因子合用对急性心肌梗死大鼠缺血损伤心肌的保护和再生作用优于单用,可改善急性心肌梗死大鼠的心室功能。

摘要：背景:干细胞因子是缺氧诱导的神经再生因子,可能刺激动物的神经再生。目的:观察大鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞巢蛋白和干细胞因子基因表达的变化,分析两者变化的时间规律。设计:随机对照动物实验。单位:青岛大学医学院附属医院超声诊断科。材料:实验选用成年健康雌性SD大鼠36只,由中国科学院上海实验动物中心提供。实验所用巢蛋白和干细胞因子mRNA原位杂交试剂盒、DAB试剂盒均由武汉博士德生物工程有限公司提供。方法:实验于2005-01/06在山东省脑病防治重点实验室完成。选取32只大鼠,应用线栓法经左侧颈外一颈内动脉插线建立左侧大脑中动脉阻塞再灌注模型,在缺血1.5h再灌注后2,6,12,24h,2,3,7,14d进行观察,每个时间点4只。其余4只为假手术组:除不插线外,其余步骤同实验组。应用原位杂交技术检测脑缺血再灌注后皮质、纹状体和室旁区巢蛋白和干细胞因子mRNA的表达。主要观察指标:大鼠皮质、纹状体和室旁区神经细胞巢蛋白和干细胞因子基因表达。结果:进入结果分析数量保持为36只。①巢蛋白mRNA表达:假手术组皮质、纹状体和室旁区巢蛋白mRNA表达很弱。缺血再灌注后,在皮质中的表达除再灌注后2h、纹状体除再灌注后2,6h以外,室旁区除2,6h,14d以外各时间点均明显高于假手术组,差异有显著性意义(P<0.05)。②干细胞因子表达:假手术组皮质、纹状体和室旁区干细胞因子表达很弱。缺血再灌注后,在皮质中的表达除2,6,12h以外,纹状体除2,6h以外,室旁区除2h,14d以外各时间点均明显高于假手术组,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:干细胞因子表达的时间规律与神经干细胞增殖的时间规律基本一致,可以提示脑缺血再灌注后干细胞因子mRNA表达可能具有促进神经干细胞增殖作用。

摘要：骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cell,BMSC)是造血微环境的重要组成成分，也是产生造血活性物质所必需的结构基础，同时也能分泌多种造血因子。BMSC受到辐射损伤后，M-CSF、G-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-4、IL-5等造血因子mRNA水平发生了变化［1］，但对于其分泌的造血调控的重要细胞因子——干细胞因子(Stem cell factor,SCF)在放射损伤后其mRNA水平有什么变化，以及这些变化与造血功能障碍之间是否有关系，至今尚未见报道。本文作者观察了体外培养的小鼠BMSC在受到不同剂量60Co γ射线照射后，其SCF mRNA转录水平的变化，以期探讨放射损伤后造血功能障碍的机理。 一、材料和方法 1.实验材料：健康雄性昆明小白鼠，体重18～22 g，本校实验动物中心提供。总RNA提取试剂盒(GIBCO BRL)，10×SYBR Green PCR buffer(PE Applied Biosystems),Taq酶、m-MLV等均为上海生物工程公司代理产品。 2.引物设计：由Genset Singapore Biotechnology Pte Ltd合成，序列顺序为：上游引物：5′-ATCTGCGGGAATCCTGTGACTG-3′，下游引物：5′-CCATATCTCGTAGCCAACAATGAC-3′。 ***培养：参照Dexter's介绍的方法［2］进行BMSC培养。每周半量换液，至贴壁细胞长满为止(约3～4周)。

摘要：目的检测核干细胞因子(Nucleostemin,NS)基因在急性白血病细胞的表达情况,探讨NS基因与急性白血病发病机制之间的关系。方法从NS基因的3个变异体中筛选出共同序列设计特异性引物,应用逆转录-聚合酶链式反应技术(RT-PCR)对白血病细胞系K562、HL60和急性粒细胞白血病(M1、M2a和M3),急性单核细胞白血病(M5a和M5b),急性淋巴细胞白血病(ALL)进行NS基因表达水平的检测,以健康人和良性贫血患者骨髓单个核细胞作为对照。PCR产物片段为418bp。结果K562、HL60明显高表达NS基因,它与内参相比灰度值分别为0·735±0·260、0·449±0·190;急性白血病病例有相似的结果。M1+M2a、M3、M5a、M5b、ALL的灰度值分别为0·687±0·210、0·408±0·160、0·866±0·270、0·448±0·190、0·403±0·190;对照组健康人和良性贫血不表达或极微弱表达NS基因;同一细胞类型白血病,细胞分化停滞在早期阶段的表达NS基因的水平明显高于细胞分化停滞在后期的白血病,如K562高于HL60;M1、M2a高于M3;M5a高于M5b(P<0·01)。结论NS基因在急性白血病细胞中呈高表达状态,这与白血病的发生、发展有一定关联;不同分化阶段的白血病细胞表达NS基因水平存在着差异。NS基因在急性白血病细胞的表达情况也显示了癌细胞和干细胞在某些方面的相似性,可能是一个潜在的基因治疗靶位。

摘要：目的　探索并建立人干细胞因子 (SCF)的原核高效表达系统。方法　设计特异性引物 ,以RT PCR从人胎肝组织中扩增出干细胞因子的膜外区活性片段 ,克隆进入pGEM T载体。以Goldkey软件进行翻译起始序列RNA结构和自由能优化 ;通过合成寡核苷酸和PCR技术将SCFcDNA中的原核稀有密码子定点突变为同义的高频密码子 ;酶切连接构建多种原核表达载体并比较它们在宿主菌中诱导表达结果。表达产物经SDS PAGE、WesternBlot和MTT活性鉴定。结果　扩增SCF膜外区序列测定正确。构建的原核表达载体 pET32a(+) SCF在大肠杆菌中获得高效融合表达 ,表达产量达 30 %以上 ,WesternBlot鉴定正确 ,初步纯化产物的活性与标准品相似。结论　根据使用的载体 /宿主系统 ,翻译起始序列 (TIS)的RNA结构和自由能优化、稀有密码子突变对表达无影响 ;SCF基因在 5′端融合要比

摘要：【目的】研究KITLG基因在猪生殖细胞发育过程中的作用。【方法】从Gen Bank下载猪KITLG序列作为参考序列,设计特异引物从版纳微型猪近交系(BMI)附睾组织中扩增KITLG基因完全编码序列及部分侧翼序列;应用半定量PCR技术检测BMI 10个重要组织的KITLG m RNA转录表达水平,并对KITLG翻译的蛋白质序列进行多种功能生物信息学分析,预测KITLG蛋白质的功能,最后构建KITLG的多物种氨基酸系统进化树。【结果】扩增得到BMI KITLG编码区序列长825 bp,编码274个氨基酸,序列已提交Gen Bank,基因登录号KU705624,对应的氨基酸登录号AOC89042。多组织相对半定量表达分析表明:KITLG基因在附睾、心、脾、肺、肾、胃中高表达,在大脑、肝、小肠和睾丸中低表达。功能生物信息学分析表明:KITLG存在1个保守结构域SCF,有1个跨膜螺旋结构,存在N端信号肽序列,N末端和C末端均亲水,二级结构以α螺旋为主,有5类功能活性位点。系统进化分析表明:KITLG在进化中高度保守,且与牛、羊的亲缘关系最近。【结论】研究结果为探索BMI KITLG基因在生殖细胞发育过程中的作用及功能奠定基础。

摘要：目的探讨干细胞因子(SCF)与维甲酸(RA)对体外培养小鼠精原干细胞的增殖作用。方法采用一步酶消化法分离纯化小鼠精原干细胞,体外培养,将RA浓度(1g/L、2g/L和4g/L)和SCF浓度(20ng/ml、30ng/ml和40ng/ml)全面组合,分成9组,每组重复三次。采用HE染色观察细胞形态,采用免疫组化检测C-kit配体;采用析因设计方差分析进行统计分析。结果固定RA因素,SCF低、中、高三组吸光度值分别为0.563±0.023,0.724±0.016和0.852±0.021,三组之间比较,相互间差异均有统计学意义(P0.05)。结论 SCF和RA均具有精原干细胞的体外增殖作用,SCF与RA之间存在交互作用,两者浓度之间最佳组合为SCF高剂量与RA中剂量组。