摘要：目的:制备并鉴定兔抗弓形虫CorA家族Mg^(2+)转运蛋白(TgMg)的特异性多克隆抗体。方法:设计并合成一段的具有较好免疫原性的、来源于TgMg氨基酸序列的短肽,短肽与KLH偶联后免疫新西兰大耳白兔,收集兔血清并分离纯化TgMg多克隆抗体,利用间接ELISA、Western印迹、间接免疫荧光等多种分子生物学方法鉴定多抗的效价、特异性及TgMg蛋白的亚细胞定位。结果:间接ELISA测定多抗效价为1∶160000;Western印迹显示该多抗能识别相对分子质量约为174×103的单一条带,表明抗体的特异性较好;用间接免疫荧光法发现TgMg定位于细胞质,与预期结果相符。结论:运用人工合成多肽结合经典的多克隆抗体制备技术制备了抗TgMg多克隆抗体,为深入研究TgMg蛋白的生物学特性及代谢功能提供了有效工具。

摘要：目的筛选刚地弓形虫主要抗原B细胞表位并在原核表达载体中表达,对纯化的表位重组蛋白进行免疫反应性鉴定。方法用计算机软件BioSun、DNAstar综合分析6个弓形虫主要抗原的亲水性、可及性、柔韧性、二级结构、极性参数等,每一抗原分子预测2个最佳表位,设计合成24条共12对寡核苷酸,两端分别引入NocI、XhoI酶切位点,退火形成的双链定向克隆至原核表达载体pET-32c中,EcoRI单酶切鉴定重组质粒Epitope/pET-32c。将含有Epitope/pET-32c的BL21单菌落接种至LB肉汤培养基中培养,导入表达。表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫印迹试验(Westernblot)分析重组表位蛋白与弓形虫抗原免疫血清的免疫反应性。结果成功构建了12个原核表达质粒Epitope/pET-32c,并经测序证实,在***21有11个表位基因能有效表达重组融合蛋白;纯化的表位蛋白大小均在20.0kDa左右;Westernblot结果显示表位蛋白SAG2-A、SAG3-B能被弓形虫抗原免疫血清识别,且反应较强,SAG2-B为弱阳性,其余的则不能被识别。结论成功筛选到3个弓形虫B细胞表位基因,为进一步构建弓形虫复合表位抗原诊断弓形虫病奠定了基础。

摘要：目的构建弓形虫Chinese 1基因型Tg Ct Wh3(以后均简称Wh3)株棒状体蛋白(rhoptry protein,ROPs)16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16的基因片段,克隆至p MD18-T载体;经PCR及测序分析鉴定;阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达载体p ET-28a和真核表达载体p EGFP-C2,分别转化大肠杆菌BL21和DH5α,PCR和酶切鉴定转化菌落插入的序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组质粒经脂质体转染293T细胞,观察其在细胞中表达;采用生物信息学方法分析构建了蛋白的3D结构。结果各组均PCR扩增出约2.1 kb ROP16基因的特异片段,序列检测结果均正确;分别亚克隆到原核表达载体p ET-28a和真核表达载体p EGFP-C2中,成功构建了Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的原核表达质粒和真核表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了ROP16的融合蛋白;真核表达质粒在293T细胞中成功表达,成功构建出ROP16基因的3D结构图。结论以p ET-28a和p EGFP-C2为载体,分别成功构建并表达了ROP16的原核和真核重组质粒,并构建出其3D结构图。

摘要：蛋白外泌是细胞中活跃的生理过程,大量的外泌囊泡与质膜融合锚定膜蛋白及分泌蛋白,SNARE是存在于运输囊泡与细胞器膜上的跨膜蛋白大家族,是囊泡融合过程的关键分子。在哺乳动物细胞中,外泌的囊泡融合通常是由突触融合蛋白Stx1和SNAP25家族蛋白SNAP25和SNAP23介导。但在弓形虫中仅存在一个SNAP25家族蛋白TgSNAP29参与顶质体的蛋白转运过程。到目前为止,尽管蛋白外泌是弓形虫能否成功入侵宿主细胞并在其中复制生长的必要过程,但弓形虫中外泌途径的分子机制尚不清楚。因此,研究弓形虫靶向顶环囊泡运输以及膜蛋白外泌的分子机制,可为新型抗弓形虫药物的设计和筛选提供新策略。

摘要：本研究方法是根据ROP2基因序列,设计合成能表达ROP2完整蛋白基因的扩增引物,扩增ROP2靶基因并克隆于PUCm-T载体,鉴定正确后,再将重组子亚克隆于真核表达载体pc-DNA3质粒中,并进一步应用PCR、双酶切、测序等鉴定其重组子的正确性。

摘要：糟糕的化学药剂化学药剂如果大量被孕妈妈吸入后,可能透过胎盘,对胎儿造成不良影响。普通的家用清洁剂一般不会给孕妇和胎儿带来什么伤害。而一些在工厂中使用的化学溶剂,如果被孕妈妈过多接触,则可能造成伤害。尤其是那些在干洗店、药店、实验室、家具厂、艺术画廊等地工作的女性,如果怀孕,就会有一定的风险。孕妈妈们可以申请暂时调离这些工作环境,到更环保、安全的岗位工作,或者在医生的指导下采取必要的防护措施。

摘要：为建立一种灵敏性高、特异性强、可自动化检测犬猫弓形虫的分子学诊断方法,本研究提取弓形虫RH虫株DNA,以致密颗粒蛋白7(GRA7)基因保守区为靶标,设计特异性引物并构建标准质粒pMD18-GRA7,以标准质粒pMD18-GRA7作为模板,建立SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR(real-time PCRor qPCR)检测方法。结果显示,该方法特异性引物只能扩增出弓形虫DNA样品,对阴性样品及其他犬猫寄生虫阳性样品DNA则未见扩增曲线。所建qPCR方法的检测下限为3 copies,当标准品浓度为3 copies/μL时,检测Ct值为29.4。对犬猫临床样品进行检测,并与商品化试剂盒结果相比校,阴阳性符合率达100%。上述结果表明,本研究建立的SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR方法特异性好,敏感性强,结果稳定,可用于犬猫弓形虫病的临床检测。

摘要：为同步检测引起奶牛流产的新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫这三种常见病原,本研究分别设计针对新孢子虫ITS1基因(Nc-ITS1)、布氏杆菌16S rRNA基因(Ba-16S rRNA)及弓形虫529 bp重复序列基因(Tg-529 bp)的特异性巢式PCR引物,建立并优化了能够同时检测这三种病原的多重巢式PCR方法。结果显示,多重巢式PCR对Nc-ITS1、Ba-16S rRNA及Tg-529 bp扩增产物的大小分别为601 bp、380 bp、245 bp。外引物退火温度为57℃,内引物为53℃;Taq酶、dNTP和Mg2+浓度分别为1.0 U、2.0 mmol/L和1.0 mmol/L;Nc-ITS1和Tg-529 bp外、内引物浓度均为0.4 m ol/L,Ba-16S rRNA为0.2 mol/L。该多重巢式PCR对Nc-ITS1和Ba-16S rRNA检测敏感性达3×102 copies/L,对Tg-529 bp达3×101 copies/L,对住肉孢子虫、大肠杆菌、沙门菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌扩增均无目的条带,表明该多重巢式PCR方法具有良好的敏感性和特异性。利用该方法对86份临床样品进行检测,结果显示新孢子虫阳性样品26份,布氏杆菌阳性样品2份,弓形虫阳性样品1份,其中新孢子虫和布氏杆菌均为阳性的样品1份,与单巢式PCR检测结果一致。结果表明,建立的多重巢式PCR方法可以用来对致奶牛流产的新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫这三种常见病原进行快速、准确地检测。

摘要：目的构建pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2多基因重组表达载体,并对其进行初步鉴定。方法根据重组体pcDNA3-p30-ROP2酶切位点和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因序列等因素设计合成引物,扩增HBsAg目的基因片段,再应用酶切、连接等分子生物学技术将HBsAg目的基因克隆至pcDNA3-p30-ROP2表达载体中。应用聚合酶链反应(PCR)初筛,再采用酶切、测序等技术对构建的重组表达载体pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2进行鉴定。结果 PCR扩增出HBsAg基因片段,构建了pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2多基因真核表达载体。PCR与酶切结果显示,该基因片段大小均与理论值相符;测序结果显示该重组表达载体包含了p30-ROP2和HBsAg目的基因的完整序列。结论成功构建了多基因重组表达载体pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2,为进一步研究多基因核酸疫苗奠定了基础。

摘要：目的探讨出生缺陷新生儿中低体质量和肺炎新生儿人巨细胞病毒(HCMV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)、HSV-Ⅱ、弓形虫(TOX)、乙肝病毒(HBV)5种病原微生物感染情况,分析巢式聚合酶链反应法检测新生儿病原体感染的临床应用价值。方法选取低体质量新生儿46例和肺炎新生儿66例,每例抽取外周静脉血1mL。经曲酚-氯仿-异戊醇-蛋白消化法,提取外周血血清中的DNA,通过二对引物,一对扩增较大DNA片段的外引物和一对在扩增产物中再扩增小片段的内引物,采用巢式PCR法,分别针对HCMV、HSV-Ⅰ、HSV-Ⅱ、TOX、HBV病毒DNA高度保守区设计引物并扩增其病毒DNA,检测这5种病毒DNA在低体质量和肺炎新生儿中感染阳性率,筛查这些病毒在出生缺陷新生儿中的感染状况。采用SPSS10.0软件分析5种病原体感染率之间的关系。结果低出生体质量新生儿46例中,5种病原体检出率:HCMV为91.3%、HSV-Ⅰ为8.7%、HSV-Ⅱ为15.2%、TOX为8.7%、HBV为15.2%;肺炎新生儿66例中,5种病原体检出率:HCMV为83.3%、HSV-Ⅰ为6.1%、HSV-Ⅱ为16.7%、TOX为6.1%、HBV为7.6%。HCMV感染率在低体质量儿和肺炎患儿中均高于其他4种病原体,且5种病原体感染率有统计学意义(Pa=0)。结论对低体质量和肺炎新生儿病原体感染进行筛查十分必要,且对新生儿感染性疾病的早期诊断和预防有益。