摘要：我国是第一大苹果生产国。苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)在我国各苹果产区分布广泛,侵染果树导致树势变弱,生长量减少,果实品质下降,严重威胁我国苹果产业的可持续发展。病毒检测是果树病毒病防控的重要前提。本研究根据苹果茎沟病毒外壳蛋白基因保守序列,设计了引物和探针,建立了微滴数字pcr(droplet digital pcr,ddpcr)检测方法。所建立的检测方法能特异性检出苹果茎沟病毒,检测重复性好,灵敏度比qRT-pcr法高10倍,可适用于田间样品及组培苗检测。该方法的建立为苹果茎沟病毒的检测提供了重要的技术手段。

摘要：为鉴定抗除草剂转基因大豆新品种‘GE-J12’的外源基因插入拷贝数,以该转化体的外源插入目的基因G2-EPSPS和GAT的序列、3′转化体特异性序列为靶序列,设计pcr扩增引物和TaqMan探针,并对引物探针特异性进行鉴定,同时以大豆内标基因Lectin为参照,建立微滴数字pcr拷贝数检测体系。特异性试验结果显示,只有以抗除草剂转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板才有扩增信号。以单株转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板,进行外源目的基因G2-EPSPS和GAT、3′转化体特异性序列的微滴数字pcr检测,转基因大豆‘GE-J12’的外源目的基因G2-EPSPS和GAT在基因组上的插入拷贝数均值分别为0.99和1.01。同时3′转化体特异性序列的拷贝数均值为1.00,验证单株转基因大豆‘GE-J12’为纯合子,因此鉴定该单株转基因大豆‘GE-J12’的外源基因在大豆基因组上为单拷贝插入,同时与Southern blot方法进行比较,结果一致。

摘要：猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)是近年来在我国新发现的一种会引起猪严重腹泻的冠状病毒,本文旨在建立一种特异性强、重复性好、灵敏度高的SADS-CoV微滴式数字聚合酶链式反应(Digital droplet pcr,ddpcr)检测方法。采用SADS-CoV的N基因作为本研究的靶基因,根据其基因序列设计特异性引物及探针。通过优化反应体系中的反应条件,分析方法特异性、敏感性和稳定性,并对临床样本和猪源产制品进行检测验证,建立了猪急性腹泻综合征冠状病毒微滴数字pcr体系。本方法确定最佳引物浓度为500 nmol/L,最佳探针浓度为250 nmol/L,且在58℃反应条件下,ddpcr检测结果最优。本方法与其他常见猪源性病毒无交叉反应,特异性强;本方法重复性好,批间与批内变异系数均小于10%。本ddpcr方法在动态范围内最低检测限为3.85拷贝/反应,比荧光定量pcr(qpcr)高10倍以上。采用qpcr和ddpcr分别对90份样品进行检测,ddpcr方法阳性检出率为13.33%(12/90)优于qpcr阳性检出率11.11%(10/90)。本文首次建立了单重SADS-CoV ddpcr检测方法,其有更优的可靠性以及抗干扰性,为定量检测动物组织、饲料、血清和粪便等样品中SADS-CoV提供了新的、稳定的技术手段。

摘要：为了建立禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)微滴数字pcr(droplet digital pcr,ddpcr)的检测方法,试验根据ARV S1133毒株S1基因序列(GenBank登录号为L39002.1)的保守区设计特异性标准品引物BQ-F/BQ-R,检测引物ARV-F/ARV-R及特异性探针(ARV-Probe);以ARV S1133毒株反转录的cDNA为模板,使用引物BQ-F/BQ-R进行pcr扩增,构建标准品质粒pMD18-T-ARV;以标准品质粒pMD18-T-ARV为模板,使用引物ARV-F/ARV-R及特异性探针进行ddpcr试验,优化引物、探针反应浓度及退火温度,并考察ddpcr检测方法的敏感性、特异性及重复性。结果表明:筛选得到引物和探针的最佳反应浓度分别为1000 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度为57.1℃。建立的ARV ddpcr最低能检测到的模板浓度为8 copies/μL;同时检测禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸡细小病毒(ChPV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、禽腺病毒(FAdV)及ARV,仅ARV为阳性,其他均为阴性;重复检测试验样品及临床样品3次,变异系数均小于15%。说明ddpcr可用于ARV的临床检测中。

摘要：为建立反刍动物埃立克体(***)准确定量的微滴数字pcr方法(ddpcr),本研究以***-inantium pCS20基因为靶基因,选取保守区域设计引物和探针,建立了*** ddpcr方法。利用本研究建立的ddpcr方法检测***、牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、无形体、犬埃立克体、牛埃立克体、马埃立克体和立氏埃立克体等,结果显示仅***出现特异性扩增,而与其他寄生虫均无交叉反应,特异性强;将pUC57-pCS20重组质粒标准品10倍倍比稀释(1×10^(-1)拷贝/μL~1×10^(5)拷贝/μL)后,利用该ddpcr方法检测,结果显示,该方法对重组质粒标准品的检测限为1.8拷贝/μL,比相应荧光定量pcr方法的敏感性高10倍,本实验建立的ddpcr方法敏感性高;批内和批间重复性试验结果变异系数(CV)均小于2%,重复性好。利用建立的ddpcr方法对50只钝眼蜱样品检测,结果显示,阳性样品反刍动物埃立克体核酸的最低拷贝数为26拷贝/μL,ddpcr和荧光定量pcr检测试剂盒的检出率均为16.0%(8/50)。本研究首次建立的ddpcr方法敏感性高、特异性强、重复性好,可作为***准确定量检测的有效手段。

摘要：目的探索一种检测22qii．2微缺失综合征的新方法。方法针对22q11．2微缺失综合征特异缺失区内的TBX1基因和内参基因RPP30设计引物和探针，采用微滴数字pcr（dropletdigitalpcr，ddpcr）的方法计算TBX1／RPP30的比值，检测22q11．2区段微缺失。结果通过数字pcr方法计算TBX1／尺PP30的比值检测22q11．2微缺失综合征，检出3例微阵列比较基因组杂交检测结果为22q11．2微缺失综合征阳性的样本。在14例临床诊断为先天性心脏病的患儿中检测出2例22q11．2微缺失阳性样本。结论微滴数字pcr可以准确检测出22q11．2区段微缺失，可提供一种快速、经济的检测先天性心脏病相关染色体22q11．2微缺失综合征的方法。

摘要：在单细胞水平研究肝组织内乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是十分重要的,但相关研究技术尚处于推进阶段,不能满足临床需要。基于微滴数字聚合酶链反应技术(digital droplet polymerase chain reaction,ddpcr),本研究建立了一套单细胞水平绝对定量HBV DNA和RNA的单细胞微滴数字pcr方法(single-cell ddpcr,sc-ddpcr)。通过混合不同比例的HBV阳性和阴性细胞来模拟HBV慢性感染状态下的肝脏,分析此方法检测HBV DNA的线性和检测下限。以cccDNA来源RNA(episome-derived RNA,eRNA)为例,进一步设计针对eRNA的sc-ddpcr检测方案。利用不同来源转录本在结构上的差异,设计针对eRNA的特异性引物探针体系,在HBV肝癌细胞系中验证此引物和探针体系的特异度,并利用梯度稀释的HBV细胞株分析此方法检测eRNA的线性和检测下限。结果显示,本研究建立了基于ddpcr的DNA和RNA的单细胞水平检测方法,该方法表现出良好的线性(HBV DNA:R^(2)=0.9987;eRNA:R^(2)=0.9425),梯度稀释的HBV细胞株均能准确检测出阳性信号,具有高灵敏度(检测下限:HBV DNA为0.16%,eRNA为0.2%)。本研究建立的sc-ddpcr方法可针对多种DNA和RNA进行检测,为进一步研究肝组织内HBV病毒学活动提供了良好的技术支撑,可以更深入地分析肝组织内HBV的病毒学特征,从而有利于HBV治疗策略的优化和研发,具有广阔的应用前景。

摘要：猪圆环病毒3型是一种新型猪圆环病毒,可引起猪感染相关疾病。本实验根据猪圆环病毒3型的OPF2基因序列,设计引物探针,建立了可对其准确定量检测的微滴数字pcr(droplet digital pcr,dd pcr)方法。通过对dd pcr反应体系中的引物探针浓度和退火温度进行优化,得到dd pcr反应的最佳引物探针浓度比为800 nM:800 nM:400 nM;最佳退火温度为60℃。该dd pcr方法的标准曲线相关系数(R2)为0.999,呈良好的线性关系;灵敏度高,可达4.4 copies/μL;特异性良好,与常见猪病原无交叉反应。通过对临床样品的检测结果证明,本研究建立的猪圆环病毒3型dd pcr检测方法比实时荧光pcr检测方法的灵敏度高1个数量级,检测结果与荧光pcr定性结果一致,并且可对可疑样本进行定量分析。结果表明:新建立的dd pcr方法灵敏度高、特异性强,可用于猪圆环病毒3型的定量检测。

摘要：为实现对猪胸膜肺炎的致病菌猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的量化研究,本实验根据猪胸膜肺炎放线杆菌特异性基因ApxⅣ的保守序列,设计引物探针,通过优化反应条件,建立可对其准确定量的微滴数字pcr(droplet digital pcr,ddpcr)检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度、稳定性以及适用性进行验证,与实时荧光定量pcr(Quantitative real-time pcr,qpcr)检测方法进行比较分析。结果表明:ddpcr最佳退火温度为52℃;线性相关系数(R^2)为0.9957,线性关系良好;灵敏度达153.8copies/μL,是qpcr的两倍;特异性良好,与其它常见猪病原无交叉反应。在实际样品检测中,110份样品的ddpcr与qpcr检测结果的Kappa系数为0.9529,说明两种检测方法结果高度一致,并且ddpcr可对qpcr无法判断阴阳性的可疑样本进行定量分析。本实验建立的ddpcr方法敏感性高、特异性强、可用于猪胸膜肺炎放线杆菌的定量检测。

摘要：目的:采用环介导等温扩增技术建立铜绿假单胞菌快速检测方法,并用微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddpcr)技术进行方法验证。方法:以铜绿假单胞菌rpod基因为靶基因设计引物,建立了果汁饮品铜绿假单胞菌快速检测方法,对于方法的可靠性、特异性和灵敏度,采用ddpcr验证。结果:本实验建立的LAMP快速检测方法显色结果明显,ddpcr检测,以铜绿假单胞菌悬液浓度为横坐标,以数字pcr扩增copy数为纵坐标,生成标准曲线y=0.07497x-9.3516,线性关系良好,R^2=0.9999。铜绿假单胞菌检测范围1.5×10~2~1.5×10~5 CFU/mL;方法灵敏度高、特异性强,标准菌株最低浓度为1 ng/μL;标准差分别为0.57、0.71、4.24、14.8,RSD值在0.66%~22.8%之间。检测果汁饮品128份,126份未显色,显色样品2份,以标准曲线定值,浓度分别为1.64×10~4、2.29×10~2 CFU/mL。