摘要：目的基于生物信息学方法筛选肾透明细胞癌关键基因,识别可能的微RNA(miRNA)-mRNA作用轴,探讨相关基因在肾透明细胞癌组织和细胞中的表达。方法选取基因表达综合(GEO)数据库基因表达谱GSE40435、GSE71302数据集,肾透明细胞癌TCGA-KIRC数据集来自癌症基因组图谱(TCGA)数据库。采用R软件筛选差异表达的mRNA和miRNA,并对mRNA进行功能富集分析。采用STRING数据库和Cytoscape软件进行蛋白质互作分析。采用Oncomir数据库筛选预后相关的差异表达miRNA。采用TargetScan和miRDB靶基因预测工具筛选miRNA可能调控的靶基因。收集2021年6月至12月山西医科大学第一医院收治的34例肾透明细胞癌患者的组织样本及临床资料,并选择正常肾细胞株293T和肾透明细胞癌细胞株786O。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测基因的相对表达量;蛋白质印迹法、免疫组织化学染色法检测目的蛋白的表达水平;双荧光素酶报告基因实验验证基因间的靶向关系。结果差异分析筛选得到1351个差异表达mRNA和50个差异表达miRNA。功能富集分析提示肾透明细胞癌中脂肪酸代谢、异生物质代谢等途径被抑制,细胞凋亡、免疫应答途径被激活。蛋白质互作分析提示肾透明细胞癌中信号转导、蛋白泛素化等途径起到关键作用。筛选结果显示miRNA-224-5p(miR-224-5p)与肾透明细胞癌进展关系最紧密,且在肿瘤组织中高表达,其预后相关靶基因为NEDD4L。肾透明细胞癌组织与癌旁组织的NEDD4L mRNA相对表达量分别为0.138±0.103、1.000±0.026(t=46.23,P<0.05);miR-224-5p相对表达量分别为1.000±0.043、0.129±0.108(t=45.28,P<0.05)。不同分级及分期肾透明细胞癌组织NEDD4L mRNA、miR-224-5p的表达差异均有统计学意义(均P<0.05)。NEDD4L蛋白在肾透明细胞癌中表达降低。293T与786O细胞中NEDD4L基因相对表达量分别为1.000±0.125、0.210±0.044(t=17.52,P<0.05);miR-224-5p基因相对表达量分别为0.209±0.049、1.000±0.234(t=10.609,P<0.05)。转染后的293T细胞样本中,miRNA模拟物组与阴性对照组的NEDD4L mRNA相对表达量分别为0.236±0.062、1.000±0.024,差异有统计学意义(t=43.56,P<0.05)。NEDD4L蛋白在miRNA模拟物组中表达降低。双荧光素酶报告基因实验提示NEDD4L是miR-224-5p的直接靶基因。结论在肾透明细胞癌中,miR-224-5p靶向调节NEDD4L表达,这一机制可能与肾透明细胞癌的发生、发展有关。

摘要：目的:了解因某些microRNA(miRNA)家族成员序列相似,以及同一种成熟miRNA的长度不均一对PCR定量检测结果的影响,寻找区分相似miRNA成员和准确定量的方法和条件。方法:采用RNA加尾和引物延伸实时定量RT-PCR法,设计不同位置错配的引物,以克隆到质粒中的全长成熟miRNA为模板,比较在不同退火温度下各种错配引物与完全匹配引物在扩增miRNA上的效率差异,并根据由此得出的经验设计let-7家族成员引物,以克隆的成熟miRNA为模板,检测其在不同退火温度下区分相似家族成员的能力。此外,设计了10组3′末端碱基位置不同的特异引物,比较了它们在检测小鼠大脑miRNA表达水平上的差异。结果:提高退火温度12℃～14℃将最大限度增加特异性而不降低敏感性,将引物的3′末端置于差异碱基或其附近可以有效区分相似miRNA序列,将引物3′末端置于miRNA第18～20个碱基,可避免漏检较短的成熟miRNA,使定量更真实准确。结论:精心设计引物并提高退火温度可提高实时定量PCR检测microRNA的特异性和准确性。

摘要：目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建两种一体化载体,用于敲除AML12细胞系中的微小RNA(microRNA,miR)-101a。方法:设计三条小鼠靶向miR-101a基因的小向导RNA(sgRNA)以及一条靶向绿色荧光蛋白基因的sgRNA,分别构建至一体化载体系统(pENTRY-U6-sgRNA-EF1α-WT Cas9),并将sgRNA1和sgRNA3构建至一体化载体系统(pENTRY-U6-sgRNA-U6-sgRNA-EF1α-Cas9 D10A)。在AML12细胞系中转染构建的一体化质粒,72 h后用T7核酸内切酶Ⅰ(T7EⅠ)检测剪切效率。将pENTRY一体化质粒通过Gateway的方式重组到pAD载体中,再转染293A细胞进行腺病毒包装。在AML12细胞系中进行腺病毒感染,72 h后检测miR-101a成熟体的表达水平以评估敲除效率。结果:构建的pENTRY一体化质粒经测序鉴定后正确。质粒转染AML12细胞系后进行T7EⅠ检测,均发生了明显剪切形成了两条带,表明设计的sgRNA有效果。pENTRY-体化质粒重组到pAD载体中,经酶切鉴定正确。腺病毒转染AML12细胞系后,实时荧光定量PCR检测表明细胞中miR-101a成熟体表达水平较对照组均明显下降(均P<0.01)。结论:构建了具有较高敲除效率的靶向小鼠miR-101a基因的一体化载体系统,为后续微小RNA功能研究奠定了技术支撑和实验基础,同时也为其他微小RNA敲除提供了借鉴方法。

摘要：目的 对与喉癌相关基因和miRNA数据进行系统的整理和分析,建立有别于目前结构复杂、庞大的生物信息数据库,为喉癌的相关研究、教学提供方便、快捷的喉癌基因、miRNA主题的综合数据库.方法 基于B/S架构,采用Apache软件作为Web服务器,以MySQL作为数据库设计的编码语言并以PHP作为网页设计的编程语言,设计基因表、蛋白质表、miRNA表和喉癌患者相关临床信息表等表单,建立喉癌基因数据库.结果 目前数据库共收录了207个喉癌相关基因、243个蛋白质和26个miRNA;本数据库可以通过互联网进行访问和操作,并实现了对资料的浏览、检索等功能,并对数据库进行维护和更新;数据库包含了喉癌相关的基因、蛋白质和miRNA及其突变、甲基化、多样化表达等信息,以及喉癌相关分子实证研究的参考文献.结论 该数据库资源整合、界面友好,提高了喉癌相关基因的使用效率和效益.

摘要：目的:分析小鼠大脑组织microRNA(miRNA)表达谱,为研究特定miRNA及其靶基因、中枢神经系统miRNA相关的调节网络,以及miRNA在中枢神经系统疾病中的作用提供参考。方法:采用RNA加尾和引物延伸序列RT-PCR法,将精心设计的特异引物按Tm值排成阵列,用梯度实时PCR仪在不同的退火温度扩增每一个miRNA,并计算出每种miRNA相对于内参的表达量。结果:共检测了285个miRNA,阳性者260个,它们丰度不同,频数分布图大致呈正态。大部分miRNA的表达水平与已发表的芯片结果一致,而阳性率高于芯片结果。源自同一miRNA前体的2个成熟miRNA表达量,有些相差无几,有些则相差甚多。同簇相邻miRNA的丰度有些相近,有些则差异明显,提示miRNA转录后的归宿决定其丰度。结论:采用实时定量PCR阵列法,分析了小鼠大脑组织的miRNA表达谱,特别是获得了一些低丰度miRNA在小鼠大脑中表达的数据,这将有助于对这些低丰度miRNA的功能研究。

摘要：目的通过病例对照研究设计，探讨江苏省南京地区汉族人群hsa-微小RNA-1（hsa—miRNA-1）靶基因COG6rs9548934C→T单核苷酸多态性改变与早发冠心病（pCAD）发生风险的关系。方法采用序贯设计收集冠状动脉造影确诊pCAD病例226例和非冠心病对照275例。用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性方法（PCR—RFLP）检测hsa—miRNA-1靶基因COG6rs9548934C→T各基因型，比较变异基因型与pCAD发生的关系。结果在rs9548934C→T多态性改变中，与CC基因型相比，携带CT，CT／啊基因型的个体罹患冠心病的风险分别降低45％和36％（校正OR=0．55，95％CI=0．36～0．82，P=0．003；校正OR=0．64，95％ CI=0．44～0．92，P：0．015）；以对照组血脂水平中位数为界值，高甘油三酯（TG）水平的个体较低TG者患冠心病的风险增高1．32倍（校正OR=2．32，95％C／=1．57—3．41，P〈0．001）；高高密度脂蛋白胆固醇（HDL—C）水平个体较低HDL—c者患冠心病的风险显著降低（校正OR=0．48，95％CI=0．31—0．75，P=0．001）。分层分析提示，携带c｜r／TT基因型个体较CC携带者罹患冠心病的风险在女性中降低更为显著（校正OR=0．54，95％C／=0．30—0．97，P=0．040）；携带CT／TT基因型个体罹患冠心病的风险在低血清TG、总胆固醇（TC）、HDL—C、低密度脂蛋白胆固醇（LDL—C）水平人群中降低更为显著（校正OR=0．62，95％CI=0．39～0．98，P=0．040；校正OR=0．55，95％CI=0．35～0．85，P=0．008；校正OR=0．43，95％CI=0．22～0．87，P=0．018；校正OR=0．49，95％CI=0．32—0．75，P=0．001）。结论hsa—miRNA-1靶基因COG6rs9548934C→T多态性改变与pCAD的发病风险降低相关，尤其在女性和低血脂水平的人群中保护作用更为显著。

摘要：目的 :分析并验证调控E74样因子3(E74-like factor 3,Elf3)表达的微RNA(microRNA,miRNA),并探索该miRNA对结直肠癌细胞功能的影响。方法 :运用数据库miRGen Targets、miRNA Viewer及MicroCosm Targets分析调控Elf3表达的miRNA。根据miRNA序列设计miRNA模拟物及抑制因子,应用miRNA转染技术改变结直肠癌SW1116细胞中该miRNA表达水平后,采用实时荧光定量-PCR法和蛋白质印迹法检测Elf3表达水平的变化。同时,提取30例结直肠癌组织及对应癌旁正常黏膜组织的RNA,反转录并实时荧光定量-PCR检测该miRNA和Elf3的表达水平。FCM和MTT法分别检测该miRNA模拟物转染对结直肠癌SW1116细胞周期、凋亡和增殖能力的影响。结果 :数据库分析显示,微RNA-198(microRNA-198,miR-198)可调控Elf3表达。应用其模拟物转染可显著提高结直肠癌SW1116细胞中miR-198水平(P0.05)。结论 :miR-198在结直肠癌中可调控Elf3的表达,并抑制结直肠癌细胞增殖。

摘要：目的:模拟miR30的框架结构设计针对HPSE的shRNA,将其克隆至慢病毒载体的CMV启动子调控的表达框内,实现Ⅱ型启动子对RNAi的有效调控。方法:设计3条基于miR30骨架的HPSE-shRNA,通过PCR获得目的片段,回收后与线性化LV PP-GFP载体连接产生重组慢病毒载体LV PP-GFP/miR-HPSE-shRNA,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用LV PP-GFP/miR-HPSE-shRNA、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒,感染A375细胞。以实时荧光定量PCR检测HPSE-mRNA的表达情况,以Westen blot检测HPSE蛋白的表达水平。结果:构建出以miR30为骨架的针对HPSE的慢病毒干扰载体,经阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确。实时荧光定量PCR和Westen blot结果表明,LV PP-GFP/miR-HPSE-shRNA重组病毒感染后A375细胞HPSE-mRNA和蛋白的表达明显降低。结论:本研究成功构建了以miR30为骨架的HPSE-shRNA慢病毒载体,实现了Ⅱ型启动子对RNAi的有效调控,为今后实现溶瘤病毒介导RNAi提供了实验依据。

摘要：目的:探讨骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨损伤中微小RNA(microRNA,miRNA)-214的作用机制及靶向基因。方法:①OA患者膝关节损伤软骨组织中miRNA-214表达量检测。根据软骨损伤程度Outerbridge分级标准将收集的OA患者膝关节软骨组织进行分级,分别提取各软骨组织的总RNA,逆转录cDNA后采用实时定量PCR检测损伤软骨组织中miRNA-214的表达量。②miRNA-214在OA大鼠软骨损伤中的作用机制分析。采用手术剪断大鼠前交叉韧带的方法建立大鼠OA模型。将40只造模成功的大鼠随机分为miRNA-214高表达组、miRNA-214低表达组、阴性对照组及模型组,将10只接受手术但不剪断前交叉韧带的大鼠纳入假手术组。设计、合成miRNA-214模拟物、miRNA-214抑制剂及miRNA-214阴性对照序列,构建慢病毒表达载体,完成病毒包装。在miRNA-214高表达组、miRNA-214低表达组、阴性对照组、模型组及假手术组大鼠右侧膝关节腔内分别注射100μL miRNA-214模拟物慢病毒混悬液、100μLmiRNA-214抑制剂慢病毒混悬液、100μL miRNA-214阴性对照慢病毒混悬液、100μL生理盐水、100μL生理盐水。干预后4周,采集各组大鼠腹主动脉血,检测血清白细胞介素(interleukin,IL)-17、IL-23水平;制备各组大鼠膝关节软骨组织石蜡切片,HE染色后观察软骨组织病理学改变;采用免疫印迹法检测各组大鼠膝关节软骨组织中聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白(collagen Ⅱ,ColⅡ)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-13的蛋白相对表达量。③OA软骨损伤相关的miRNA-214靶向基因分析。检索miRNA靶基因数据库中miRNA-214的靶向基因,根据文献资料筛选与骨代谢相关的人类miRNA-214靶向基因。采用双荧光素酶实验验证miRNA-214对活化转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)的靶向性。采用免疫印迹法检测各组大鼠右侧膝关节软骨组织中ATF4的蛋白相对表达量。结果:①OA患者膝关节损伤软骨组织中miRNA-214表达量检测结果。共收集38例OA患者的膝关节软骨组织,其中Ⅲ级28例、Ⅳ级10例。Ⅳ级损伤软骨组织的miRNA-214相对表达量高于Ⅲ级(1.67±0.40,0.51±0.16,t=12.941,P=0.000)。②大鼠血清炎症因子水平检测结果。5组大鼠血清IL-17、IL-23水平比较,组间差异有统计学意义[(62.94±8.12)pg·mL^(-1),(45.19±5.34)pg·mL^(-1),(44.63±6.67)pg·mL^(-1),(24.74±3.90)pg·mL^(-1),(18.15±2.33)pg·mL^(-1),F=94.153,P=0.000;(72.39±10.26)pg·mL^(-1),(48.70±5.87)pg·mL^(-1),(47.59±5.76)pg·mL^(-1),(27.54±4.05)pg·mL^(-1),(18.13±3.05)pg·mL^(-1),F=111.701,P=0.000]。miRNA-214高表达组、阴性对照组、模型组及miRNA-214低表达组大鼠血清IL-17、IL-23水平均高于假手术组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);miRNA-214高表达组大鼠血清IL-17、IL-23水平均高于阴性对照组、模型组及miRNA-214低表达组(P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000,P=0.000);miRNA-214低表达组大鼠血清IL-17、IL-23水平均低于阴性对照组和模型组(P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000);阴性对照组大鼠血清IL-17、IL-23水平与模型组比较,组间差异均无统计学意义(P=0.838,P=0.675)。③大鼠软骨组织病理学检查结果。HE染色结果显示,假手术组软骨组织潮线清晰,结构完整,软骨细胞分布均匀;阴性对照组、模型组软骨组织潮线模糊不清,结构严重破坏,软骨细胞聚集;miRNA-214高表达组软骨组织损伤情况较阴性对照组、模型组更为严重;miRNA-214低表达组软骨组织潮线可辨识,结构较为完整,软骨细胞聚集现象较阴性对照组、模型组及miRNA-214高表达组有所改善。④大鼠软骨组织聚集蛋白聚糖、ColⅡ、MMP-13蛋白表达量检测结果。5组大鼠软骨组织聚集蛋白聚糖、ColⅡ、MMP-13

摘要：目的探讨胶质瘤细胞中miR-218及细胞周期蛋白依赖性激酶6（CDK6）表达变化的相互关系及其对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法采用组织微阵列、锁定寡核苷酸探针原位杂交及免疫组织化学（ABC法）方法，检测60例不同级别胶质瘤组织标本及10例对照脑组织中miR-218、CDK6及Ki-67抗原的表达状况，并分析三者之间的相互关系；胶质母细胞瘤细胞系（U87MG）分别被转染阴性对照序列（对照组）及miR-218mimics（mimics组），采用即时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）及免疫细胞化学方法分别检测两组细胞中的miR-218水平及CDK6和Ki-67表达变化，用单细胞凝胶电泳检测凋亡细胞。结果对照组、I～Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤组miR-218阳性标记指数（LI，％）分别为22．45±0．59、4．00±1．07、1．87±1．06、0．94±0．78，四组问差异均有统计学意义（P〈0．05）；各组CDK6L1分别为7．254-1．20、16．71±0．80、24．43±0．62、32．05±0．43，对照组与各胶质瘤组问及Ⅳ级组与I～Ⅱ级组间差异有统计学意义（P〈0．01）；各组Ki-67阳性细胞密度分别为0．00±0．00、9．30±3．48、31．15±9．44、60．15±13．60[（面-4-s）／0．05mm。]，各组间差异均有统计学意义（P〈0．01）；miR一218LI与CDK6LI及Ki-67阳性细胞密度问均呈显著性负相关（r：-0．480，-0．534，P〈0．01），后两者问呈显著性正相关（r=0．530，P〈0．01）。mimics组的miR-218水平明显高于对照组，其CDK6及Ki-67LI（14．74±1．19、30．88±3．31）均明显低于对照组（79．06±2．07、64．94±3．96，P〈0．01），而凋亡指数（68．44±7．05）明显高于对照组（13．04±0．97），以上各指标两组间差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论miR-218表达水平是评价胶质瘤良恶性程度的重要参考指标；其表达异常减少可导致胶质瘤细胞CDK6表达及增殖活性增强；补充外源性miR-218可有效下调恶性胶质瘤细胞CDK6表达、抑制其增殖和促进其凋亡，故在恶性胶质瘤基因治疗中具有重要的潜在应用价值。