摘要：目的构建ErbB4基因特异性miRNA表达载体并检测其有效性。方法设计合成大鼠ErbB4基因特异性miRNA前体寡核苷酸,构建ErbB4基因特异性的重组miRNA干扰质粒。从大鼠脑分离提取总RNA,经RT-PCR构建靶序列质粒,并将其与miRNA干扰质粒共转染HEK293T细胞,经实时定量RT-PCR技术鉴定其干扰有效性。结果与结论针对ErbB4基因的miRNA干扰质粒构建成功,并能够有效抑制其靶基因的表达。该质粒为后续ErbB4基因特异性miRNA慢病毒表达载体的构建及ErbB4的相关功能研究奠定了基础。

摘要：【摘要】目的探讨肺癌患者血清／外周血单个核细胞（PBMC）mieroRNA（miltNAs）表达谱的变化及其意义。方法本研究属于临床病例对照研究。建立基于实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术检测miRNA的方法，对其进行定量研究；2011年11月至2012年9月收集苏州大学附属第一医院住院及门诊肺癌患者61例，肺部良性疾病及健康对照各48例，各组间性别、年龄匹配，年龄为64（40-85）岁；采用RT-qPCR技术检测血清及配对PBMC中miR．20a、miR-21、mitl-25、mitl-29a、miR-31、miR-126、miR-129、miR-145、miR-205的表达水平，以U6为内参，用F=2^△Ct法计算。其中△Ct=CtmiRNA-CtU6。F表示目标miRNA表达量相对于同一样本u6的变化倍数。采用SPSS19．0软件进行统计分析，两组样本的比较采用成组设计的两样本t检验，多组数据的比较采用单因素方差分析，若差异有统计学意义，多组数据两两间的比较采用S-N-K检验，两变量之间关系采用Pearson相关性分析，对各样本中u6的ct值是否相等作Brown-Forsythe检验。结果肺癌患者血清miR．20a（F=271．64，P〈0．01）、mill-21（F=2232．51，P〈0．01）、miR-205（F=45．13，P〈0．01）、miR-29a（F=19．98，P〈0．01）、miR-25（F=313．19，P〈0．01）、miR-126（F=32．38，P〈0．叭）与健康对照组、肺部良性疾病组之间差异有统计学意义，且其中miR-29a（健康对照组3．27±2．44，肺部良性疾病组3．19±0．32，肺癌组0．99±2．31）、miR-25（健康对照组3．88±0．62，肺部良性疾病组3．42±0．51，肺癌组1．79±0．37）、miR-126（健康对照组3．19±1．77，肺部良性疾病组2．67±1．55，肺癌组0．96±0．84）在肺部疾病恶性化发展中呈下调趋势；肺癌miR-31（比值=1．85，P〈0．01）与健康对照相比升高，miR．145（比值=-3．00，P〈0．05）则下降；不同分化程度的肺癌患者血清mill-31（F=5．22，P〈0．01）表达差异有统计学意义，中分化时期（1．40±0．39）表达最高；当全身转移（特别是骨转移）时，miR-31（无转移1．16±0．40，有转移1．03±0．24，P〈0．05）表达下降。在与肺癌患者血清配对PBMC中，mill-126（F=690．58，P〈0．01）、miR-129（F=26．66，P〈0．01）、miR-145（F=48．57，P〈0．01）、miR-205（F=308．61，P〈0．01）、mill-25（F=218．57，P〈0．01）、miR-31（F=48．05，P〈0．01）与健康对照组、肺部良性疾病组之间差异有统计学意义，且其中miR-25（健康对照组6．54±0．63，肺部良性疾病组5．82±0．51，肺癌组3．97±0．55）、mill-31（健康对照组4．26±0．43，肺部良性疾病组4．08±0．37，肺癌组3．43±0．38）在肺部疾病恶性化发展中呈下调趋势；肺癌miR-20a（比值=1．39，P〈0．01）、miR．29a（比值=1．42，P〈0．01）与健康对照相比均升高；当全身转移时，miR-21（无转移5．11±0．24，有转移5．28±0．24，P〈0．05）表达上升；患者miR-31血清和PBMC中的表达水平呈负相关（r=-0．369，P〈0．05）；血清miR-29a（S=0．968，P〈0．01）、miR-25（S=0．906，P〈0．01）、miR-126（S=0．969，P〈0．01）的t／OC曲线下面积有统计学意义。结论miRNA可能参与了肺癌转移的多个步骤，包括局部浸润、渗出血管或在远处的初步生存和转移灶生长等，也可能影响肺癌的预后。mittNA的检测可为肺癌的进展机制提供一个新的研究线索。

摘要：目的探讨microRNA-92（miR-92）对神经母细胞瘤细胞增殖的促进作用，并预测miR-92的靶基因。方法人工设计合成miR-92的反义寡核苷酸（anti—miR-92寡核苷酸），利用脂质体LipofectamineTM2000转染神经母细胞瘤SK-N-SH和SK-N-BE2细胞系，利用实时定量PCR检测转染后细胞内miR-92的表达水平，并通过噻唑蓝（MTT）比色法和流式细胞仪检测细胞的增殖和凋亡情况；利用生物信息学方法对miR-92的候选靶基因进行预测。结果与对照组细胞相比，两种神经母细胞瘤细胞转染anti-miR-92后，miR-92的水平降低约70％，MTT检测细胞的活性降低约20％，流式分析仪检测发现增殖的细胞数降低约50％～60％，而细胞凋亡数增加约2～3倍，差异均具有统计学意义（P〈0．05）。通过生物信息学和对靶基因潜在功能分析，初步选定BCL2-like11（BCL2L11）和phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten （PTEN）作为是miR-92的候选靶基因。结论抑制miR_92的表达导致神经母细胞瘤细胞的增殖降低，凋亡增加，从而可能进一步影响神经母细胞瘤的生长，miR-92可能具有作为临床上神经母细胞瘤治疗分子标记物的潜在功能，为以后更有意义的分子治疗奠定基础。

摘要：目的构建和筛选小鼠P4503A11基因miR RNAi慢病毒载体,建立CYP3A11基因knock-down小鼠。方法利用Ravi Sachidanandam's Lab的在线软件设计沉默小鼠P4503A11基因的miRNA所对应的shRNA序列,PCR扩增后克隆到PCI-GFP-MiR质粒中,其再与慢病毒载体FUW进行重组。将psPAX2和pMD2.G两个载体和FUW-GFP-MiR-shRNA重组慢病毒载体共转染293FT细胞,包装成病毒。用包装好的病毒液感染293FT细胞后,并利用GFP蛋白表达水平进行滴度测定。将上述重组慢病毒载体分别转染FVB/N小鼠肝细胞,转染48h后,检测P4503A11基因mRNA表达水平的变化。选取干扰效果最好的FUW-GFP-MiR-shRNA1重组慢病毒载体进行制备基因knock-down小鼠模型。用显微注射法将浓缩的shRNA1病毒液注射至FVB/N小鼠12细胞期胚胎透明带下。将注射后发育至22细胞期的胚胎移植至假孕受体母鼠,得F0代小鼠。在紫外光照射下利用滤光片观察GFP在小鼠活体内的表达水平。结果DNA测序结果显示3个重组慢病毒载体均与所设计的shRNA序列一致。检测的3个浓缩前慢病毒悬液的滴度均≥106TU/ml,经过高速离心对病毒进行浓缩和纯化,其滴度达到109TU/ml以上。转染FUW-GFP-MiR-shRNA1、2的2组肝细胞的P4503A11基因mRNA表达水平相对于空白对照组均显著下降(P<0.05),而转染阴性对照FUW-GFP-MiR-shRNA-NC的肝细胞P4503A11基因mRNA表达水平相对于空白对照组无明显改变。选用FUW-GFP-MiR-shRNA1慢病毒载体制备的F0代3A11基因knock-down小鼠,在紫外光照射下,阳性小鼠可见较强的荧光。结论构建并筛选出小鼠P4503A11基因有效的靶向miR RNAi慢病毒载体,并成功建立CYP3A11基因knock-down小鼠。

摘要：目的构建microRNAlet-7a重组慢病毒表达载体,建立稳定表达let-7a的睾丸卵黄囊瘤细胞株(TYST-1),并探索let-7a过表达后对睾丸卵黄囊瘤(TYST)细胞增殖的影响。方法根据miRBase数据库let-7a的序列,设计合适的引物序列,利用聚合酶链反应(PCR)钓取目的基因片段,经过扩增、酶切后,与慢病毒载体GV309连接。转化DH5α感受态细胞,阳性克隆进行PCR及测序鉴定。293T细胞中包装慢病毒,利用荧光法测定病毒滴度。将构建好的let-7a慢病毒载体感染睾丸卵黄囊瘤(TYST)细胞,经嘌呤霉素筛选并扩大培养后得到稳定克隆株,建立稳定表达let-7a的TYST-1。用Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)检测let-7a表达水平,用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测let-7a过表达后对TYST细胞增殖的影响。结果构建的let-7a慢病毒载体经质粒酶切和测序鉴定正确;let-7a慢病毒感染组细胞内let-7a水平比阴性病毒对照组和空白对照组分别提高3.O倍和3.8倍(P<O.05)。CCK-8法细胞增殖试验结果显示,较空白组和阴性病毒组,let-7a慢病毒感染组细胞的增殖能力明显受到抑制(P<O.05)。结论成功构建let-7a慢病毒载体并感染TYST细胞,获得稳定过表达let-7a的TYST-1;并证实let-7a过表达后抑制了TYST细胞的增殖。

摘要：目的构建大鼠IP3R1miRNA慢病毒表达载体,并利用PC12细胞株观察其对IP3R1基因的沉默效应。方法根据已公布的IP3R1基因序列(***_001007235),设计并合成4对miRNA的OligoDNA(miRNA1、miRNA2、miRNA3和miRNA4),退火形成双链DNA后,与载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR连接,构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-IP3R1表达载体;用Gateway技术将该表达载体先后与中间载体pDONRTM221、慢病毒载体pLenti6/V5-DEST连接,构建慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-IP3R1,包装产生慢病毒,收集上清,感染PC12细胞株,用Real-timePCR和Western blotting技术检测慢病毒表达载体对PC12细胞内IP3R1表达的沉默效应。结果测序结果表明,4对pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-IP3R1表达载体序列与参考序列一致,将重组获得的慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-IP3R1转染至PC12细胞株,48h后IP3R1的mRNA和蛋白表达下调,以miR-NA2和miRNA3的沉默效应最佳。结论成功构建了大鼠IP3R1慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-IP3R1,其可使大鼠PC12细胞株IP3R1表达下调,为利用RNA干扰技术进一步研究细胞内钙释放通道的功能奠定了基础。

摘要：目的探讨miRNA-146a(miR-146a)、miRNA-196a2(miR-196a2)和miRNA-499(miR-499)单核苷酸多态性与肝细胞癌遗传易感性的关系。方法采用病例对照研究设计。选取扬州大学附属医院2015年4月至2019年3月收治的肝细胞癌患者175例(肝细胞癌组)及同时期门诊体检的302名健康体检者(对照组)。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法检测两组外周血中miR-146a、miR-196a2和miR-499基因分型的分布情况,采用logistic回归模型分析3个miRNA的基因型、肝炎病毒感染者基因型与肝细胞癌遗传易感性的关系,采用Spearman相关分析法研究miR-146a基因多态性与人口学因素及临床特征间的关系。结果肝细胞癌组miR-146a单核苷酸多态性位点CC、CG、GG基因型分别为52例(29.7%)、86例(49.1%)、37例(21.1%),对照组分别为137名(45.4%)、135名(44.7%)、30名(9.9%),两组间基因型分布差异有统计学意义(χ^(2)=17.23,P0.05)。在乙型肝炎病毒(HBV)阳性的肝细胞癌患者中,miR-146a的CG和GG基因型发生肝细胞癌的风险分别是CC基因型的2.02倍(95%CI 1.06~5.07)和3.12倍(95%CI 1.66~10.07),CG+GG基因型是CC基因型的1.91倍(95%CI 1.85~3.38),GG基因型是CG+GG型的1.54倍(95%CI 1.15~6.08);在丙型肝炎病毒(HCV)感染或无HBV和HCV感染的肝细胞癌患者中,未发现miR-146a基因多态性增加肝细胞癌发生的风险。Spearman相关分析显示,miR-146a多态性与患者年龄、性别、吸烟、饮酒、肿瘤家族史、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶均无相关性(均P>0.05)。结论 miR-146a的GG和CG基因型增加肝细胞癌尤其HBV感染患者的遗传易感性;miR-196a2和miR-499单核苷酸多态性未增加肝细胞癌的发生风险。

摘要：目的:构建靶向survivin的microRNA表达载体,观察其与siRNA表达载体对survivin基因表达的抑制作用.方法:以survivin为靶基因,根据pPRIME设计针对survivin的microRNA序列,获得目的片段克隆到相应载体中,序列正确的载体脂质体转染前列腺癌PC-3细胞,RT-PCR和Western Blot检测其对survivin基因表达的抑制作用,流式细胞术和电镜观察其对细胞凋亡的影响.结果:双酶切鉴定、DNA测序证实构建的microRNA表达载体序列正确,序列正确的microR-NA和siRNA表达载体在mRNA和蛋白水平上均能明显抑制PC-3细胞中survivin的表达,流式细胞术和电镜结果显示其可促进PC-3细胞的凋亡,且microRNA表达载体的作用效果较siRNA表达载体强.结论:Survivin靶向microRNA和siRNA均能抑制靶基因的表达,诱导前列腺癌细胞凋亡,与siRNA相比,microRNA作用效果更强.

摘要：目的建立稳定感染人hsa-miR-100-3p抑制剂慢病毒表达载体的人支气管上皮(human bronchial epithelial,BEAS-2B)细胞株,为研究miR-100的功能奠定基础。方法根据hsa-miR-100-3p的成熟序列,设计其反向互补序列,用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法扩增目的基因,将目的基因与慢病毒载体GV280经双酶切后,进行定向连接,产生GV280-hsa-miR-100-3p-inhibitor慢病毒表达载体。将制备好的重组慢病毒质粒与两种辅助包装原件载体质粒共转染人胚肾上皮细胞293(human embryo kidney epithelial cell,HEK-293)T细胞,包装产生病毒颗粒并以最适滴度感染BEAS-2B细胞以获得稳定感染的细胞株。倒置荧光显微镜观察感染效率,用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)的方法检测重组慢病毒感染后BEAS-2B细胞中miR-100的相对表达量。结果测序结果表明,目的基因成功的连接到慢病毒载体上,重组慢病毒高效的感染了BEAS-2B细胞。RT-PCR检测发现,BEAS-2B细胞中miR-100的相对表达明显的下调了。结论稳定感染hsa-miR-100-3p抑制剂的BEAS-2B细胞株构建成功,敲低了细胞中内源性miR-100的表达。

摘要：目的探究下调微小RNA-564(miR-564)基因对滑膜间充质干细胞成软骨分化的作用。方法取第3代的人滑膜间充质干细胞(SMSCs)作为实验细胞,实验设计为3组:SMSCs空白对照组(空白组); miRNA抑制剂转染SMSCs对照组(对照组); miR-564抑制剂转染SMSCs实验组(实验组)。将3组SMSCs同时成软骨诱导培养,观察诱导后软骨细胞的组织形态,并检测诱导前7 d内的3组细胞增殖曲线,和软骨分化特异性基因和蛋白[Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、性别决定区Y框蛋白9(Sox9)、母亲DPP同源物4(Smad4)];本次实验所有数据均采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验。结果甲苯胺蓝染色观察细胞形态与特点基本符合软骨细胞,实验组细胞数量更多,蓝染更明显;细胞增殖曲线表明实验组细胞增殖速度明显快于对照组(F=0. 842,P <0. 01); RT-PCR检测与Western Blotting检测表明实验组软骨细胞分化特异基因和蛋白表达较对照组明显升高(F=2274. 75,F=447. 31,F=30476. 22; P <0. 01),并且实验组TGF-BMP关键基因及蛋白Smad 4有所升高(F=457. 02,P <0. 01)。结论下调miR-564基因的表达可促进滑膜间充质干细胞向软骨细胞增殖与分化,并且有可能是通过作用于TGF-BMP通路实现。