摘要：蛤蚧为我国名贵动物中药材,为建立蛤蚧的LAMP可视化检测方法,实现其与混伪品的高效特异鉴别,该研究通过MEGA 6.0分析蛤蚧与其13种混伪品共65条12S rRNA序列,在线设计LAMP引物,并优化扩增条件,考察反应灵敏度,对蛤蚧及其混伪品进行鉴别验证。结果表明,基于12S rRNA序列的蛤蚧及其13种混伪品均可通过BLAST比对准确区分。蛤蚧12S rRNA序列较为保守,10批次30条序列在引物设计区仅含2条单倍型和3个变异位点,成功设计了6条LAMP特异引物。64℃反应1 h,80℃灭活5 min,即可完成蛤蚧的可视化检测,最低检测浓度为5μg·L-1,高于传统PCR 2个数量级。该方法特异性强、灵敏度高、检测方便、反应时间短,且闭管操作,避免了污染,可实现蛤蚧与混伪品的快速可视化鉴别。

摘要：光肩星天牛Anoplophora glabripennis和星天牛A. chinensis同属鞘翅目天牛科星天牛属,均为世界性林业蛀干害虫。前者主要为害杨树、柳树、榆树等阔叶树,后者主要为害柑橘、苦楝、木麻黄、柳树等林果植物。2种天牛常以卵或幼虫虫态在港口被截获,从形态上难以区分。在分子标记技术上,随机扩增多态性 DNA 标记(random amplified polymorphicDNA,RAPD)具有简单、灵敏、对材料要求低等优点;ITS-1序列在种内较保守,便于设计引物,目前多用于近缘种鉴定和种群分化的研究。

摘要：肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、木糖葡萄球菌(***)、腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)、马胃葡萄球菌(S. equorum)和松鼠葡萄球菌(S. sciuri)是发酵肉制品中常见的葡萄球菌,为准确、快速地检测和鉴定这些菌种,建立6种葡萄球菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法并进行验证。以上述菌种的gap、rpoB、SodA和SNc为靶基因,设计和筛选菌种特异性引物6对,优化PCR体系,建立6种葡萄球菌的多重PCR鉴定方法。实验结果显示多重PCR的基因组DNA检测灵敏度可达到4 pg,活菌检测灵敏度可达到2×10~2 CFU;采用建立的多重PCR方法对传统肉制品中分离的8株葡萄球菌进行鉴定,结果与16S rDNA序列分析、生理生化鉴定结果一致。建立的多重PCR方法具有较高的种间特异性,可快速、准确地用于发酵肉制品中肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、松鼠葡萄球菌和腐生葡萄球菌的检测和鉴定,具有较好的应用前景。

摘要：采用多重实时荧光PCR技术的高通量特征,对转基因玉米MIR604、GA21、DAS-40278-9和98140的特异性靶标序列设计TaqMan-MGB荧光探针,通过退火温度和引物探针浓度梯度优化建立了四重实时荧光PCR检测方法,经特异性,重复性和灵敏性等方法学验证确认了方法的可靠性。MIR604、GA21、DAS-40278-9、981404个特异性基因的标准曲线回归方程分别为y=-3.263 x+36.632,y=-3.422 x+36.384,y=-3.294 x+38.978和y=-3.278 x+37.514;Ct值变化范围分别在23.556~37.524、22.893~37.412、25.304~39.110和24.501~37.618之间;标准偏差分别在0.078~0.476,0.085~0.463,0.120~0.487和0.148~0.353之间;相关系数R 2分别为0.997,0.996,0.995和0.993;检出限可达10个拷贝,扩增效率满足欧盟等国际要求。

摘要：松茸(Tricholoma matsutake)是一种稀有、珍贵的野生食用菌,至今还无法人工栽培,目前菌菇市场中存在大量假冒松茸商品。文章建立了快速鉴定松茸及其制品的可视化核酸试纸条法。该方法设计特异性引物,通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增特异性鉴定松茸特异性基因标志物,优化扩增条件为退火温度63 ℃、15个循环。扩增产物使用胶体金核酸试纸条检测,松茸样本均出现2条红色条带,同时凝胶电泳验证可扩增出352 bp特异性DNA片段。其他菌类及空白对照均在质控线出现1条红色条带,检测线无显色条带,且凝胶电泳无扩增条带,结果特异良好。该方法灵敏度高、稳定性强,模板DNA的最低检出量为0.1 ng/μL,检测试纸条可在常温保存至少12个月。所建立的松茸特异性基因标志物成分检测的可视化核酸试纸条方法检测性能优异,结果稳定可视、操作简便,适用于松茸原料和加工制品的现场检测。

摘要：目的利用可视化和实时荧光环介导等温扩增(LAMP)技术,建立日本红菇的快速鉴别方法。方法基于日本红菇内转录间隔区的基因序列设计了特异性的LAMP引物,在23种蘑菇物种间进行特异性验证,通过检测10 ng/μL~1 fg/μL系列浓度的基因组DNA,评估方法的灵敏度。结果设计的LAMP引物可特异性鉴别日本红菇,不与其他蘑菇种类发生交叉反应。建立的LAMP方法检测灵敏度为1%混合蘑菇样本,或终浓度为2 pg/μL的日本红菇DNA。结论本方法可用于新鲜/干制蘑菇及烹饪后蘑菇的检测,检测时间<1 h,其中可视化方法无需专业仪器设备,适用于日本红菇的现场快速鉴别。

摘要：新菠萝灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes(Beardsley)是一种严重为害剑麻、番荔枝等经济作物的入侵性害虫。由于粉蚧类昆虫体型较小,且外部形态十分相似,难以达到快速准确识别。本文利用分子标记技术,研究了新菠萝灰粉蚧的快速鉴定方法。通过对新菠萝灰粉蚧、扶桑绵粉蚧、双条拂粉蚧、杰克贝尔氏粉蚧、大洋臀纹粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗粉蚧和木瓜粉蚧等8种粉蚧的序列进行分析,针对新菠萝灰粉蚧设计了1对特异性引物,其扩增片段大小为552 bp(Gen Bank登录号为MF 363108),该引物对其它7种粉蚧没有扩增能力。该引物不仅对新菠萝灰粉蚧成虫具有扩增效能,对1龄若虫、2龄若虫和3龄若虫都具有同样的扩增能力,其最低检出阈值为437.5 pg/μL。该技术的建立,实现了在剑麻等苗木调运过程中对新菠萝灰粉蚧的快速准确鉴定,同时对新菠萝灰粉蚧的检疫和监测也具有重要的意义。

摘要：【目的】瘤胫实蝇为我国进境植物检疫性有害生物。寄主范围广、危害大,形态与其同属近缘种相似,传统鉴定方法是将果蔬上的各虫态饲养至成虫后进行分类鉴定,鉴定周期较长,影响口岸进境果蔬快速通关,而采用分子鉴定不仅快速且不受虫态影响。【方法】选用瘤胫实蝇为鉴定靶标,番石榴实蝇、锈红果实蝇等19种实蝇作阴性对照,应用种特异性技术,基于mtDNA COⅠ线粒体基因序列,研究筛选并设计一对种特异性引物(SS-COⅠ)LJF400和LJR564,进行PCR扩增并将PCR产物进行电泳检测。【结果】种特异性引物仅对靶标种瘤胫实蝇的COⅠ基因有扩增能力,能扩增出一条单一的长度约165 bp清晰的条带,而对其余阴性对照种均不具有扩增效果,未出现任何条带。【结论】设计的种特异性引物具高特异性,能够快速准确鉴定瘤胫实蝇,适用于各种虫态,对瘤胫实蝇的检疫鉴定和进境果蔬的快速通关具有重要意义。

摘要：【目的】辣椒实蝇Bactrocera latifrons(Hendel)为我国重要的检疫性有害生物,其寄主范围广泛,危害严重。由于传统鉴定方法受到饲养周期、饲养条件、虫态等因素的限制,使得果蔬进出口贸易通关速度、疫情快速鉴定受到较大的影响,因此迫切需要开发关于实蝇的快速鉴定识别的技术。【方法】本研究基于mt DNA COI序列设计了一对能够准确鉴定辣椒实蝇的种特异性引物FL680和RL1057,选用辣椒实蝇作为阳性对照,选用番石榴实蝇***(Bezzi)、桔小实蝇***(Hendel)和颜带实蝇***(Hendel)等20种实蝇作为阴性对照,进行PCR扩增并将PCR产物进行电泳检测。【结果】仅目标种辣椒实蝇能够扩增出清晰且单一的约378 bp的条带,其余实蝇种类均未出现条带。将本实验建立的种特异性PCR(SS-PCR)鉴定方法应用于实际检疫工作中并得到了验证,表明该方法具有强的种特异性。【结论】本文提出辣椒实蝇快速鉴定识别技术可应用于实蝇的疫情监测和口岸的检疫检测工作。

摘要：【目的】针对粉虱类害虫种类多、体型微小、形态相似、难以准确快速识别的问题,以新入侵我国大陆的甘蓝粉虱Aleyrodes proletella(L.)为靶标,以田间常见的其他10种/隐种粉虱为参照,采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I(mitochondrial DNA cytochrome c oxidase subunit I,mt DNA COI)基因的种特异性(species-specific COI,SS-COI)PCR方法,研究其快速分子检测技术。【方法】利用mt DNA COI基因通用型引物LCO-1490/HCO-2198获得甘蓝粉虱及其他常见粉虱的COI序列,根据测序结果设计种特异性SS-COI引物1对(APZYJF/APZYJR),其扩增片段大小为384 bp,同时对该对引物的种特异性及灵敏性进行检测。【结果】种特异性检验结果显示,该对引物仅对甘蓝粉虱的mt DNA COI基因具有扩增效果,对我国常见的其他种类的粉虱包括温室粉虱Trialeurodes vaporariorum(Westwood)、柑橘粉虱Dialeurodes citri(Ashmead)、螺旋粉虱Aleurodicus disperses(Russell)、双钩巢粉虱Paraleyrodes pseudonaranjae Martin、非洲伯粉虱Bemisia afer(Priesner et Hosny)以及烟粉虱***(Gennadius)5个隐种(MED,Asia I,Asia II 1,Asia II 3和China 1)等不具有交叉反应扩增能力。灵敏性检验结果显示,该对引物不仅对不同性别的成虫具有良好的扩增效能,对2-4龄若虫甚至单粒卵或单头初孵若虫亦具有同样的扩增能力,其最低检测阈值为14.00±0.37 pg/μL(相当于1/25 600头雌性成虫)。【结论】该技术体系完全可用于甘蓝粉虱的快速准确识别及检测监测,对有效阻截其进一步扩张蔓延意义重大。