摘要：为建立一种简单、快速的急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)检测方法,本研究根据pirB基因保守序列设计了多组引物和exo探针组合,经过筛选优化,建立了VpAHPND实时荧光RPA检测方法。结果显示,该方法在42℃恒温反应15 min即可快速、特异性地检测出急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND),与其他虾类病原和养殖环境中的致病菌不发生交叉反应,最低菌体细胞检出浓度为3.8×10^(2)CFU/mL,质粒检测限为1.17×10^(1)copies/μL,且具有良好的重复性。利用本研究建立的实时荧光RPA方法与WOAH推荐的实时荧光qPCR方法对50份人工感染的南美白对虾样品进行检测,二者检测结果一致。结果表明,本研究建立的检测方法操作简单,反应灵敏,仪器依赖性低,结果可靠,适用于实验室和现场对VpAHPND快速检测。

摘要：根据pirAVp基因保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,经优化反应体系及条件,建立检测致对虾急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR方法;以重组质粒为标准品制作标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验.结果表明:该方法定量范围宽,起始模板浓度范围为1×10^1~1×10^9拷贝/反应时,标准曲线具良好的线性关系;最低检测限约为10拷贝/反应,与对虾其他病原菌及病毒无交叉反应,重复试验变异系数为0.37%~0.47%,可在1h内完成单个样品检测;对临床对虾样品及水样的检测结果表明,与世界动物卫生组织(OIE)推荐的套式PCR法相比,可提高VpAHPND的阳性检出率,且检测为阳性的样品包含全部套式PCR法检测为阳性的样品.可见,应用TaqMan-MGB探针建立的检测VpAHPND的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、能快速定量等优点,可用于临床对虾样品及水样的VpAHPND检测.

摘要：为了建立一种敏感、特异的致对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的一类弧菌(VpAHPND)的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Gen Bank中该类弧菌(本研究所用的VpAHPND为副溶血弧菌变异株,下同)PirB毒素基因(KU145397),设计q PCR扩增引物,并采用该引物经PCR扩增PirB基因片段,构建重组质粒p MD18-T-PirB并经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品。以10倍倍比稀释的重组质粒标准品进行q PCR扩增,建立标准曲线,并经反应条件优化初步建立了检测该类VpAHPND的SYBR Green I q PCR方法。以白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、虾虹彩病毒、虾肝肠胞虫及该VpAHPND的基因组DNA为模板,采用本研究建立的SYBR Green I q PCR方法检测,评估该方法的特异性;以8.3×10^(1)拷贝/μL~8.3×10^(8)拷贝/μL的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的SYBR Green I q PCR以及常规PCR检测,比较两种方法的敏感性;以3个不同浓度的质粒标准品作为模板,利用该方法分别进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。建立的该q PCR方法的标准曲线显示,各浓度的质粒标准品的拷贝数与其Ct值均呈良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.998。特异性试验结果显示,该方法仅能检出VpAHPND,而其他病原均为阴性结果,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对质粒标准品的检测限为83拷贝/μL,敏感性是水产行业标准常规PCR的1000倍。重复性试验结果显示,批内和批间重复性试验变异系数分别在0.31%~0.81%和2.05%~4.34%,重复性好。利用该方法对61株虾源弧菌样品检测,结果显示阳性检出率为29.5%(18/61),阴性样品检测率为70.5%(43/61),与行业标准的常规PCR检测方法结果完全一致,二者的阳性符合率为100%,总符合率为100%。本研究建立了一类致对虾VpAHPND的SYBR Green I q PCR检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为AHPND的诊断、监测与流行病学调查提供技术支撑。

摘要：为建立一种简单、快速的现场检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)的方法,根据VpAHPND pVA1质粒pirB基因保守序列设计RAA-nfo特异性引物和探针,建立了VpAHPND核酸RAA-LFD检测方法。该方法特异性强,仅对VpAHPND特定毒力株核酸检测为阳性,与副溶血弧菌非毒力株、霍乱弧菌、志贺氏菌、沙门氏菌、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病病毒(IHHNV)、十足目虹彩病毒(DIV1)、虾肝肠胞虫(EHP)等病原核酸无交叉反应;灵敏度高,最低可检测到3.8×10^(2) CFU/mL的菌体细胞,质粒检测限为1.17×10^(1) copies/μL;检测时间短,37℃恒温反应20 min,以LFD显色5 min后即可完成结果判定;同时该方法具有良好的重复性和可信度,利用该方法和世界动物卫生组织(WOAH)推荐的qPCR方法平行检测58株副溶血弧菌分离株,二者符合率为100%。结果表明,本研究建立的RAA-LFD方法特异、灵敏、反应快速、操作简单且结果肉眼可视,适用于VpAHPND的现场快速检测。

摘要：针对对虾急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)病原菌检测,建立了一种重组酶介导等温扩增(recombinase acid amplification,RAA)检测方法。根据pVA1质粒保守序列设计特异性探针和引物,分别以不同稀释浓度梯度的含pirB靶序列的重组质粒pMD18-T-pirB为模板进行荧光RAA法检测,评价其灵敏度;对溶藻弧菌、河流弧菌、创伤弧菌等病原菌进行荧光RAA法检测,评价其特异性;取8.2×10^(3 )copies/μL浓度的pMD18-T-pirB重组质粒进行荧光RAA试验,评价其重复性;对人工感染样品用RAA方法进行应用试验,以水产行业标准(SC/T 7233—2020)推荐的荧光探针PCR法作为平行对照。结果显示:该方法可对pirB靶序列基因片段进行有效扩增,最低检出限为8.2×101 copies/μL,与其他病原菌无交叉反应,重复试验变异系数为0.41%,与荧光探针PCR方法符合率为100%。结果表明,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好、操作步骤简单,可用于对虾样品的AHPND现场检测。本研究为AHPND快速检测提供了技术支撑。

摘要：为建立急性肝胰腺坏死病(Acute Hepato Pancrentic Necrosis Disease,AHPND)实时荧光重组酶介导扩增(Recombinase Aided Amplification,RAA)快速检测方法,根据NCBI中致急性肝胰腺坏死病的副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp_(AHPND))中PVA1质粒的保守序列设计了3对引物和1条探针,通过荧光值和出峰时间,筛选引物、优化反应温度、评估方法的敏感性和特异性,同时把该方法应用于临床模拟环境DNA(Environmental DNA,e DNA)样品检测。结果显示,筛选出的Vp_(AHPND)的F2/R2引物组特异性强,仅能扩增Vp_(AHPND)阳性核酸,与常见的对虾病原肝肠胞虫(Enterocytozoon Hepato Penaei,EHP)、白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus,IHHNV)、细菌性肝胰腺坏死(Infection with Hepatobacter Penaei,NHPB)、十足目虹彩病毒1型感染(Decapod Iridescent Virus 1,DIV1)、副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus,VP)均无交叉反应;检测方法灵敏度高,检测限低至1.4×10^(2)copies/μL,并且在20 min内快速完成了Vp_(AHPND)的检测。采用实时荧光RAA法,在64份临床模拟环境DNA(e DNA)样品中检出Vp_(AHPND)阳性8份,检测结果与荧光定量PCR检测方法一致。研究表明e DNA采样策略与Vp_(AHPND)的实时荧光RAA检测方法相结合,能大大提升临床诊断速度,可为急性肝胰腺坏死病快速检测提供重要的技术依据。

摘要：急性肝胰腺坏死病(AHPND)是对虾养殖过程中最常见、最严重的疾病,给对虾养殖造成重大经济损失。AHPND病原种类多、基因型复杂,现有的针对不同病原的检测技术目标导向较弱、检测成本高、时间消耗长,对虾健康养殖亟待开发AHPND的精准快速诊断技术。本研究针对AHPND病原体携带编码一种二元毒素pirA和pirB大型质粒的遗传共性,基于pirA和pirB基因设计特异性引物并建立微流控荧光定量PCR检测方法。该方法对致病基因pirA和pirB特异性强、灵敏度高,最低检测限分别为5.43×10^(0)和4.31×10^(1)copies/μL,样品平均检测时间为26min左右。为进一步评估该方法在实际应用中的准确性,以含有pirA和pirB毒性质粒的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行人工感染实验。结果表明,感染后的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃丝、肝胰腺、肠道和肌肉等组织随时间的推迟均能检测到pirA和pirB;从感染2h的结果来看,pirB比pirA检出率更高。此外,致病因子pirA和pirB比toxR的检出率更高,更适合对AHPND致病原的检测。本研究建立的微流控荧光定量PCR检测的方法具有快速、灵敏、高通量、污染少、现场检测、一体化集成等优点。该技术不仅适用于实验室,更符合养殖基层的现场快速检测需求,为及早认知疾病发生风险和病害精准防控提供了新的技术手段与理论支撑。

摘要：【目的】建立一种对虾急性肝胰腺坏死病(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease)病原菌副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VpAHPND)荧光定量PCR检测方法,对该病进行快速检测。【方法】根据副溶血弧菌基因保守序列设计特异性引物和探针,经优化反应体系及条件,建立检测VpAHPND的荧光定量PCR方法;以重组质粒为标准品制作标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。【结果】该方法定量范围宽,起始模板浓度范围为2.3×10^(1)~2.3×10^(7)拷贝/μL时,标准曲线具有良好的线性关系;最低检测限为2.3拷贝/μL,与对虾其他病原菌及病毒无交叉反应,重复试验变异系数为0.45%~0.69%,可在1 h内完成样品检测;对临床对虾样品的检测结果表明,该方法与世界动物卫生组织(OIE)推荐的套式PCR法检测结果一致。【结论】应用TaqMan探针建立的检测VpAHPND的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特点,可有效用于临床对虾样品的VpAHPND检测。

摘要：为了快速检测致对虾急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌(VP_(AHPND))和肝肠胞虫(EHP)这2种病原,根据NCBI中副溶血弧菌pirAB^(VP)毒素基因和肝肠胞虫SWP1基因的保守序列设计并合成特异性引物和Taq Man探针,通过优化反应条件,评估方法的特异性、灵敏度、重复性,并且把该方法应用于环境DNA(eDNA)样品检测。结果显示所建立的双重荧光PCR方法特异性强,仅能扩增出V_(PAHPND)和EHP的阳性核酸,与对虾常见病原白斑综合征病毒、传染性皮下和造血器官坏死病毒、十足目虹彩病毒1等均无交叉反应;VP_(AHPND)和EHP的最低检测限分别为14和1.4 copies/μL;组内和组间重复的变异系数均≤1.9%。从56批e DNA样品检测结果发现,VPAHPND阳性7批(12.5%),EHP阳性4批(7.14%),其中VPAHPND-EHP双重感染2批(3.57%)。这表明基于e DNA识别技术,该VPAHPND和EHP双重荧光PCR可以大大提升临床实验室的对虾疫病诊断速度,为海关等监管部门提供可靠高效的快速检测方法。