摘要：目的:建立急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者C-KIT基因N822位点突变的drop-off微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法,并评价其临床应用价值。方法:针对C-KIT基因第17外显子设计一对引物及探针,优化drop-off ddPCR反应条件及体系,评价该方法的特异性、灵敏度、重复性,使用所建立的方法对140例已行Sanger测序的AML初诊患者骨髓标本进行检测,并用二代测序(next generation sequencing, NGS)验证结果;用drop-off ddPCR对3例阳性患者化疗后C-KIT突变频率进行动态监测。结果:drop-off ddPCR检测C-KIT基因N822位点突变的最适退火温度为54℃,空白检测限为1.62拷贝数/μL,最低检测下限为10.12拷贝数/μL,线性良好。140例AML初诊患者样本中Sanger测序检出2例阳性(1.4%),而ddPCR共检出突变7例(5.0%),突变频率为0.29%~7.41%;进一步应用常规NGS方法对ddPCR阳性样本进行验证,共检出阳性3例(2.1%),等位基因频率为1.26%~8.00%。动态监测3例阳性患者C-KIT突变频率,结果显示治疗达完全缓解时C-KIT突变频率明显下降甚至降低至0。结论:本研究建立了检测C-KIT基因N822位点突变的drop-off ddPCR技术,具有良好的方法学检测性能,其灵敏度高于Sanger测序和NGS,有望用于阳性患者缓解后的可检测残留疾病监测及治疗指导。

摘要：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是原始和幼稚髓性细胞在骨髓、外周血和其他组织中异常增殖或积聚,导致正常造血功能受损的一种基因异质性疾病。研究表明,大约30%的AML患者体内存在FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3,FLT3)激活突变,FLT3的异常调节与AML的发生及发展密切相关。FLT3已经成为开发小分子靶向药物的重要靶点,截至目前,以FLT3为靶点开发出来了多种FLT3抑制剂和FLT3降解剂,相关化合物表现出较好的抗AML活性。本文总结了以FLT3为靶点的AML治疗药物的研究进展,以期为AML药物研发和设计提供参考。

摘要：急性髓系白血病(AML)是一种异质性很强的恶性血液系统疾病,20%~30%的初诊患者诱导化疗失败,完全缓解(CR)的患者中有相当一部分会复发[1]。这部分患者挽救治疗方案的选择需要根据一般情况、遗传学特点、前期治疗用药等确定。另外,部分初诊AML患者在确诊时身体状况较差或合并症多,只能接受低强度治疗或减低剂量的化疗方案。基于此,我们设计了阿扎胞苷(AZA)联合高三尖杉酯碱(HHT)和阿糖胞苷(Ara-C)方案(AZA+HA)用于难治复发AML患者的挽救治疗以及不适合强化疗患者的诱导治疗。

摘要：目的　探索急性髓系白血病 (AML)逆转录病毒病因的可能性。方法　运用已获得的逆转录病毒 6 # 11克隆为探针和引物 ,通过Northernblot和RT PCR技术检测AML患者白血病细胞中相关逆转录病毒基因的表达情况。结果　以 6 # 11为探针 ,Northernblot杂交的阳性条带在 9.4kb和 4.5kb左右 ,19例AML患者白血病细胞中 18例出现了阳性条带 ;RT PCR设计的引物扩增片段长度为 790bp ,14例AML患者白血病细胞中阳性表达 11例。结论　AML患者白血病细胞中相关逆转录病毒基因呈特异性表达。

摘要：美国国立癌症研究所（NCI）1988年8月26日组织了一次急性髓系白血病（AML）诊断和疗效标准专题讨论会，旨在规范AML临床试验的设计标准。随着对AML细胞生物学、遗传学、分子生物学特征认识的不断深入，此外，不同作用和毒理机制的新药不断发现，有必要对1988年提出的美国NCIAML诊断和疗效判断标准进行修订，为此，2001年5月23～25日在西班牙的马德里举行了一个国际工作组会议并提出了“国际工作组关于AML治疗试验的诊断、疗效标准的标准化、治疗结局和报告标准的修订建议”。

摘要：目的 RASSF1A基因异常甲基化可能参与血液肿瘤的发生,并为微小残留疾病(minimal residual de-sease,MRD)监测、分层、预后评估及靶向治疗提供依据。本研究旨在分析RASSF1A基因启动子区异常甲基化在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中的临床意义。方法选取2005-01-01-2013-03-01解放军总医院(113例)以及第一附属医院(39例)住院患者和门诊体检患者,共152例AML患者骨髓标本以及15例健康供者骨髓标本纳入本项研究。提取基因组DNA,并进行DNA硫化修饰;设计重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BS-PCR)引物以及甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MS-PCR)引物,进行PCR扩增,进而电泳分析以及DNA序列分析。同时对RASSF1A高甲基化组以及低甲基化组的血液学特点、骨髓原始细胞比例、细胞遗传学异常、基因异常、完全缓解率和总生存期进行统计学分析。结果 MS-PCR分析结果显示,RASSF1A基因在15例健康人中呈完全非甲基化状态,在152例AML患者中有38例出现启动子区高甲基化状态,其甲基化阳性率为25%。4例MS-PCR阳性AML患者经BS-PCR测序分析后,显示RASSF1A甲基化率分别为88.2%、85.5%、78.6%和92.7%,而在4例MS-PCR阴性患者RASSF1A基因启动子区甲基化率分别为10%、11.8%、12.7%和6.8%,4例健康供者RASSF1A基因启动子区甲基化率分别为5.0%、9.1%、8.2%和7.3%。进而通过统计学分析发现携带RASSF1A基因高甲基化的AML患者易合并存在ASXL1基因突变或DNMT3A基因突变。携带RASSF1A基因高甲基化的AML患者,其无进展生存期以及总生存期较短。结论 RASSF1A基因启动子区异常甲基化可能参与AML的发生,同时可能为AML分层诊治以及预后评估提供分子理论依据。

摘要：本研究建立急性髓系白血病CBFB-MYH11融合基因检测新方法并探讨其应用价值。通过检索文献及数据库,确定已报道CBFB-MYH11融合基因的所有融合形式,据此设计引物和探针并构建了3个阳性质粒和阴性细胞系作为对照,完成多重实时PCR扩增CBFB-MYH11融合基因和GUSB(内控基因)的检测体系。使用该体系对58份急性髓系白血病标本进行分析并对所有检出的阳性标本进行测序验证。PCR扩增结果显示,本方法可对所有阳性质粒进行有效检测,且灵敏度均可达10个拷贝;在58份标本中,检出4份阳性标本,阳性率6.9%,分别为A型和J型。与染色体核型分析结果相比,本方法多检出了1例阳性标本;与测序相比,结果均一致。结论:本研究建立的逆转录多重PCR检测体系可用于筛查所有融合形式的CBFB-MYH11融合基因,具有快速、全面、灵敏、可靠的优点,有助于临床上CBFB-MYH11融合基因阳性患者的诊断和疗效评价。

摘要：化疗是急性髓系白血病的标准治疗手段,然而白血病细胞多药耐药的产生为白血病化疗的主要障碍.在耐阿霉素的K562细胞株(K562/ADR)中,MRP4表达较不耐药的K562细胞株明显增高.本研究试图运用慢病毒介导的siRNA沉默MRP4基因后研究能否增强K562/ADR对阿霉素的敏感性.首先设计并构建了5个针对MRP4基因的慢病毒介导的siRNA(lv-shRNAs-MRP4);随后用荧光显微镜观察lv-shRNA-MRP4感染K562/ADR细胞的感染效率;用real-time PCR及Western blot检测感染lv-shRNA-MRP4后K562/ADR细胞MRP4mRNA及蛋白表达;应用MTS法及流式细胞术检测感染lv-shRNAs-MRP4后K562/ADR细胞增殖活性及凋亡.荧光显微镜观察结果可见,K562/ADR细胞lv-shRNA-MRP4感染效率达到80%以上;相比较其他lv-shRNAs-MRP4,lv-shRNA1-MRP4对MRP4基因沉默效应最强;在K562/ADR细胞中lv-shRNA1-MRP4组mRNA及蛋白表达均较对照组明显受抑;联合lv-shRNA1-MRP4与阿霉素后K562/ADR细胞生长受抑且细胞凋亡增加.上述结果提示,MRP4基因可能参与了K562/ADR细胞株多药耐药机制,慢病毒介导的siRNA沉默MRP4基因可增强急性髓系白血病对阿霉素的敏感性.

摘要：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是异质性造血干细胞恶性克隆性疾病,主要表现为外周血、骨髓以及其他组织中的原始细胞克隆性扩增。近年来,AML发病率呈逐年增加的趋势,对人类健康产生巨大的威胁。在不同种族及不同性别中,AML发病率及死亡率存在显著差异。AML是一种复杂疾病,与遗传突变及异常表观遗传修饰密切相关。DNA甲基化是重要的表观遗传修饰,AML相关基因的异常DNA甲基化修饰对疾病的发生发展极其重要。该文对AML相关基因的异常甲基化修饰进行了系统的作用机制分析,并对重要基因进行了功能分类。该文总结的具有异常DNA甲基化修饰的基因,有望辅助预测AML的治疗及预后效果,并为设计个体化AML治疗方案提供全新的思路。

摘要：目的:建立检测急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)神经母细胞瘤RAS病毒癌基因同源物(NRAS)基因突变的drop-off微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法,并评价该方法的临床应用价值。方法:针对NRAS G12和G13突变位点设计特异性drop-off ddPCR引物和探针,建立最佳反应体系,并对该方法进行性能验证。应用该方法对140例临床样本进行初筛,其检测结果与Sanger测序进行比较,并用二代测序(next generation sequencing,NGS)进行验证。结果:建立drop-off ddPCR检测NRAS基因G12/G13突变的方法,灵敏度达0.158%,重复性、线性良好,其空白限为5.40拷贝数/μL,最低检测下限为15.84拷贝数/μL。在140例初诊AML患者中,drop-off ddPCR检出NRAS突变28例(20%),其突变负荷为0.26%~52.85%(中位2.14%);而Sanger测序仅检出7例(5%)阳性,为进一步验证,将21例Sanger测序结果阴性而drop-off ddPCR检测阳性的样本进行NRAS基因NGS,检出14例阳性,而另外7例NGS阴性的样本,其drop-off ddPCR检测突变频率为0.53%~1.50%(中位1.10%)。结论:建立了drop-off ddPCR技术检测AML患者中NRAS基因突变的方法,该方法灵敏度高,可用于对NRAS基因G12/G13突变进行定量检测,有望可用于AML患者预后判断和疾病监测。