摘要：目的:应用RNA干扰技术,以人BIRC5基因为靶基因,设计合成3对短发夹结构的互补DNA序列和一对阴性对照序列,构建慢病毒干扰载体并鉴定。方法:将设计合成的单链引物退火成双链oligo序列,连接入经AgeI和EcoR I双酶切线性化的pMAGic慢病毒质粒载体中,经转化DH5α感受态细胞并筛选出阳性克隆,采用PCR扩增和DNA测序鉴定阳性克隆。结果:PCR扩增产物经凝胶电泳阳性克隆得到335 bp条带,阴性克隆得到298 bp条带,DNA测序结果证实其含设计合成序列。结论:4对BIRC5 shRNA重组慢病毒表达载体构建成功,为研究靶向BIRC5 siRNA对肿瘤细胞增殖抑制与诱导凋亡作用及基因治疗研究奠定了实验基础。

摘要：目的构建大鼠少突胶质细胞转录因子2(Olig2)的慢病毒表达载体,并转染少突胶质前体细胞(OPCs),观察Olig2过表达对OPCs向少突胶质细胞(OLs)分化的影响。方法设计合成PCR引物,从大鼠pEGFP-N3-Olig2表达质粒中扩增并克隆大鼠Olig2-EGFP片段,将其插入到pLenti6.3慢病毒表达载体中,形成pLenti6.3-Olig2-EGFP慢病毒表达载体。将其与包装质粒混合后共转染293T细胞,包装产生慢病毒后感染培养的OPCs,观察Olig2在感染细胞中的表达并鉴定其表达对OPCs向OLs分化的影响。结果成功将大鼠Olig2-EGFP片段克隆入pLenti6.3慢病毒表达载体,构建的pLenti6.3-Olig2-EGFP慢病毒表达载体能够高效表达。与空质粒转染的OPCs相比,重组质粒转染的OPCs体外诱导分化后产生更多的OLs(n=5,P<0.01)。结论成功建立大鼠pLenti6.3-Olig2-EGFP慢病毒表达系统,慢病毒介导的Olig2过表达促进大鼠OPCs向OLs分化。

摘要：目的利用RNA干扰技术,以人CCL20基因为靶基因,设计CCL20基因特异性的小干扰RNA(siRNA),构建其短发夹RNA(shRNA)重组慢病毒表达载体,并进行测序鉴定。方法设计并合成人CCL20基因特异性的DNA寡核苷酸,连接到经SpeⅠ和SalⅠ双酶切线性化的pHSER dsRNA GFP SIN质粒上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性菌落、扩增后提取质粒,进行DNA测序鉴定。结果将合成的两对人CCL20基因特异性DNA寡核苷酸序列退火后,分别克隆到线性化的pHSER dsRNA GFP SIN载体质粒上。在氨苄青霉素培养基条件下,筛选出相应的阳性菌落,经DNA测序鉴定确实为所需序列。结论构建成功了2对人CCL20基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体,可进一步用于干扰CCL20基因的mRNA转录,从而为制备CCL20基因表达抑制型的人角朊干细胞奠定基础。

摘要：目的:构建针对前列腺特异性膜抗原(PSMA)的CAR慢病毒表达载体,并包装病毒颗粒。方法:设计并合成针对PSMA的CAR基因序列,将设计的CAR片段连入pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-puro载体中,经酶切、PCR及测序鉴定构建是否成功。应用慢病毒三质粒包装系统将PSMA-CAR载体进行包装,通过荧光显微镜观察及流式细胞仪检测GFP鉴定包装结果及包装时的转染效率。通过超速离心方法浓缩病毒颗粒。结果:成功构建了PSMA-CAR慢病毒表达载体,成功包装了PSMA-CAR慢病毒颗粒且包装时的转染效率为70.43%,经测定获得的PSMA-CAR慢病毒滴度为5×105TU/mL。结论:PSMA-CAR慢病毒表达载体的成功构建及病毒颗粒的包装为应用CAR技术治疗前列腺癌奠定了基础。

摘要：目的：Hegdehog信号通路在胰腺癌发生发展过程中发挥着重要的作用,针对其调控机制的研究将对胰腺癌发病机制的阐明奠定良好的理论基础.构建携带SMO靶向si RNA慢病毒表达载体,并证实其对胰腺癌细胞中SMO基因表达的抑制作用.方法：设计并合成3条SMO基因靶向si RNA片段,利用基因重组技术构建携带此3条片段的慢病毒表达载体并测定其滴度,构建好的慢病毒表达载体转染人胰腺癌细胞株SW1990后,采用RT-PCR法检测SMO基因的表达以筛选出效果最佳的干扰表达载体,并以此载体转染SW1990细胞后采用Western blot法检测SMO蛋白表达.结果：基因测序与酶切电泳结果提示成功合成SMO靶向siRNA片段且其正确插入慢病毒表达载体,无碱基缺失错排与突变,测定病毒滴度分别为5.31×10~8TU/m L,1.49×10~9TU/m L及8.50×10~8TU/m L,经转染SW1990细胞后,测定对SMO基因表达的抑制率分别为86.00%、74.85%及19.22%,效果最优的干扰表达载体转染SW1990细胞后对SMO蛋白表达的抑制率〉80%.结论：成功构建携带SMO基因靶向si RNA的慢病毒表达载体,且该载体可有效抑制胰腺癌细胞中SMO基因的表达,为进一步的研究提供了良好的实验工具.

摘要：目的构建靶向has-miR-181b基因的慢病毒表达载体。方法根据has-miR-181b序列设计互补的单链寡核苷酸引物序列进行退火延伸后连入经双酶切的pGCSIL-GFP载体质粒,与辅助元件载体质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0共同导入感受态细胞T293进行慢病毒包装,收集、浓缩并测定病毒滴度。用所得病毒转染U87胶质瘤细胞;实时定量PCR检测转染后miR-181b表达,流式细胞术检测细胞凋亡以及Transwell实验评价细胞侵袭能力的改变。结果目的序列成功连接入载体,测序分析证实目的序列载体构建成功,并测得病毒滴度为6×109 TU/ml;病毒转染U87胶质瘤细胞能够显著上调has-miR-181b表达,该病毒载体能够有效诱导胶质瘤细胞凋亡,显著抑制U87细胞的侵袭性。结论成功建立高效稳定表达has-miR-181b的慢病毒转染系统,体外实验中能够有效诱导U87胶质瘤细胞凋亡,并且可以抑制胶质瘤的侵袭能力。

摘要：目的构建hsa-miR-424基因慢病毒表达载体,并鉴定miR-424在细胞内表达水平,研究hsa-miR-424对宫颈癌Hela细胞增殖的影响。方法以人基因组DNA为模板,设计合成miR-424的上下游引物,PCR扩增目的片段,回收产物将其连入pMD18T载体中,进行测序。再以pMD18T-miR424为模板进行PCR扩增,将其中表达pMD18T-miR424的结构经酶切后插入pLentis-CMV-GFP-MCS-PGK-PURO载体,构建成pLentis-CMV-GFP-miR424-PGK-PURO,在293T细胞中与pSPAX2、pMD2.G包装产生所需的慢病毒,再用含慢病毒的上清液感染Hela细胞。结果 miR-424基因与慢病毒载体连接成功,测序结果证明了插入到质粒载体中的miR-424前体序列完全正确,成功构建pLentis-CMV-GFP-miR424重组慢病毒载体,用其感染宫颈癌Hela细胞后上调miR-424的表达近60倍。采用MTT法检测增殖结果提示:感染miR-424慢病毒的宫颈癌Hela细胞株均存在细胞增殖减慢。结论成功的构建了miR-424慢病毒载体,建立了高效稳定表达miR-424的细胞株,并用含慢病毒的上清液感染宫颈癌Hela细胞,成功抑制了Hela细胞的增殖,为后续相关的研究奠定了良好的基础。

摘要：目的:基于Cre-Lox P系统构建携带EGFP及Puromycin抗性基因,并带有巨细胞病毒(CMV)及翻译延伸因子1α(EF1α)双启动子的新型慢病毒表达载体,为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒载体系统.方法:以已经插入Lox P序列的p LOX-TERT-ires TK慢病毒载体为模板,用Spe I与Kpn I进行双酶切,去除TERT-ires TK片段,然后与人工设计合成的多克隆位点片段连接,构建p LOX-MCS表达载体.同时,以p B513载体为模板扩增EF1α-EGFP-Puro表达框(带有Bam HI及Kpn I酶切位点),然后与经过Bam HI及Kpn I双酶切的p LOX-MCS载体连接,进而构建p LOX-CMV-EF1α-EGFP-Puro(简称p LOX-CMV-E/P)载体.将p LOX-CMV-E/P载体与慢病毒包装载体p CMVR8.74及p MD2.G共转染293T细胞,包装病毒进行报告基因的功能分析.结果:菌落聚合酶链式反应(PCR)、酶切鉴定及测序结果均与预期结果一致,绿色荧光蛋白及抗药性基因均有较好的活性与功能.结论:成功构建了p LOX-MCS及p LOX-CMV-E/P慢病毒表达载体,为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒表达系统.

摘要：目的构建NOC2L基因重组慢病毒并使其在293T细胞中表达。方法通过设计引物及PCR扩增获得NOC2L全基因片段,将pCDH-GFP载体分别用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切制备线性化载体;NOC2L全基因片段和线性化载体经切胶回收后,通过同源重组反应将NOC2L全基因片段连接到线性化的pCDH-GFP载体上,构建pCDH-NOC2L-GFP慢病毒表达载体;通过菌落PCR、质粒双酶切、测序等方法对构建的NOC2L基因重组慢病毒表达载体进行鉴定,利用构建的pCDH-NOC2L-GFP包装NOC2L慢病毒并使用该慢病毒感染293T细胞。结果菌落PCR、质粒双酶切和测序结果显示成功将NOC2L基因连接到pCDH-GFP载体上,使用构建成功的pCDH-NOC2L-GFP转染293T细胞,能够成功转染及包装NOC2L基因重组慢病毒,同时包装好的NOC2L基因重组慢病毒能够成功感染293T细胞并过表达293T细胞中的NOC2L基因。结论采用本研究方法能成功构建NOC2L基因重组慢病毒表达载体。

摘要：目的构建人分化型胚胎软骨发育基因1(DEC1)的短发卡RNA(shRNA)慢病毒表达载体并建立稳定敲减DEC1表达的人脑胶质瘤细胞株T98G。方法根据Gen Bank中DEC1基因c DNA序列设计合成两条特异性shRNA序列,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照,分别克隆到PsiLVRU6MP质粒载体内,经酶切电泳、DNA测序鉴定后包装成慢病毒颗粒。再以3组慢病毒感染胶质瘤细胞系T98G,用嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜下观察m Cherry的表达,Western Blot检测各组DEC1蛋白的表达水平。结果 DEC1基因shRNA慢病毒表达载体经酶切、测序鉴定证实克隆正确。荧光显微镜检测显示各组细胞均已被慢病毒高效感染。Western Blot结果显示,两干扰组细胞各自DEC1蛋白表达水平明显低于未处理组和阴性对照组,分别占未处理组的39.47%±0.69%和41.17%±0.89%(P0.05);阴性对照组与未处理组相比亦无明显差异(P>0.05)。结论成功构建DEC1基因shRNA慢病毒表达载体,感染胶质瘤T98G细胞系获得成功。两干扰组慢病毒均能明显敲减目的基因DEC1的表达,为进一步研究DEC1在胶质瘤细胞系T98G中的生物学功能和作用机制提供了实验基础。