摘要：目的:应用RNA干扰技术构建BimS慢病毒RNA干扰载体,探讨其感染效率和干扰效果。方法:针对人BimS设计3个干扰靶点,将单链引物退火成双链oligo序列,连接入AgeI和EcoRI双酶切线性化载体中。将重组质粒进行病毒包装、并且通过感染ACC-2细胞观察其感染效率,定量PCR检测其对BimS mRNA干扰效果。结果:PCR产物经扩增电泳后阳性克隆得到337bp条带,插入序列片段与DNA测序结果完全相符。重组慢病毒载体在293T细胞中包装获得滴度为2×10~8 TU/ml的病毒颗粒,MOI=20,转染效率为85%。转染pFU-GV-BmS-1组、pFU-GV-BmS-2组及对照组BmS mRNA相对表达水平分别为:0.743±0.025、0.466±0.023、1.266±0.042(组间两两比较,P<0.05)。结论:BimS慢病毒RNA干扰载体构建成功,并能高效感染ACC-2细胞及下调BmS mRNA表达。

摘要：目的:构建Pri-miRNA-21/23A基因的重组病毒载体,并在L-02肝细胞中获得表达。方法:设计并合成Pri-miRNA-21/23a的基因产物,插入含绿色荧光蛋白Zsgreen基因的真核表达载体pCI Mamma Lian中,以重组质粒为模板,设计扩增含Zsgreen基因的Pri-miRNA序列产物,并将其与pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro病毒载体连接,将Pri-miRNA重组病毒载体转染293T细胞后进行病毒包装,病毒上清转染L-02肝细胞后用荧光显微镜及实时荧光定量PCR确认转染效果。结果:荧光定量PCR结果显示重组病毒上清转染L-02肝细胞感染效果良好,经荧光显微镜观察,证实重组病毒载体能在细胞中表达蛋白。结论:构建了Pri-miRNA21/23a重组病毒表达载体并在L-02肝细胞中表达,奠定了miRNA进一步功能研究的基础。

摘要：目的 构建大鼠色素上皮衍生因子（PEDF）44mer基因的慢病毒表达载体并检测其表达.方法 化学合成PEDF 44mer-6his,亚克隆入GV206载体,测序鉴定.挑取阳性克隆转染293T细胞,实时荧光定量PCR法测定病毒滴度.将已构建的病毒转染293T细胞,RT-PCR和Western blot法检测44mer-6his表达.结果 阳性克隆测序与设计的44mer基因序列完全一致,44mer慢病毒构建成功.实时荧光定量 PCR法检测病毒滴度为2.00E＋9 TU/ml.44mer慢病毒转染293T细胞后,RT-PCR检测到44mer表达.Western blot显示44mer-6his融合蛋白表达阳性.结论 成功设计构建了PEDF 44mer慢病毒,为进一步研究44mer在缺血性心肌病中的作用和机制奠定基础.

摘要：本试验旨在克隆水牛阴阳因子1(YY1)基因,并筛选获得可有效抑制水牛YY1基因表达的shRNA干扰片段。以水牛成纤维细胞cDNA为模板,采用RT-PCR方法,扩增水牛YY1基因CDS序列,将其连接插入到pMD18-T载体中,进行序列测序并分析。采用Xho I和EcoR I双酶切,将水牛YY1基因编码区定向克隆至pEGFP-N1载体中,构建其真核表达载体pYY1-EGFP-N1。设计2条靶向水牛YY1基因的shRNA序列并构建其慢病毒表达载体,命名为pSicoR-GFP-YY1 shRNA1/2。以pSicoR-GFP和pSieoR-GFP-1864分别为空白对照和阴性对照质粒,采用脂质体转染方法,将YY1真核表达载体分别与2条shRNA慢病毒表达载体共转染293T细胞,48h后观察绿色荧光蛋白EGFP表达情况;72h收集共转染细胞样品,采用qRT-PCR和western-blot方法分析YY1基因的表达水平。结果表明,克隆得到1248 bp的水牛YY1基因CDS序列,其与牛YY1基因的同源性达99%。构建的水牛YY1基因真核表达载体pYY1-EGFP-N1能在水牛胎儿成纤维细胞(BFF)中瞬时表达。酶切分析及序列测定结果表明,所构建的shRNA慢病毒表达载体pSieoR-GFP-YY1 shRNA1/2为阳性克隆。质粒共转染293T细胞48h后,可观察到绿色荧光蛋白EGFP的表达。qRT-PCR结果显示,设计合成的2条shRNA对水牛YY1基因的表达均有抑制效果,其中YY1 shRNA2的抑制效果(93.64%)显著高于YY1 shRNA1(50.77%)(P<0.05),Western-blot分析结果显示,2条shRNA对YY1蛋白表达均有抑制效果。以上结果说明克隆得到水牛YY1基因编码区序列,并获得2条有效抑制其表达的shRNA片段,为进一步阐明YY1基因在水牛早期胚胎发育过程中的作用奠定了基础。

摘要：目的构建Mg^(2+)/Mn^(2+)依赖性蛋白磷酸酶1A(PPM1A)基因的短发卡RNA(shRNA)慢病毒表达载体,并建立稳定敲低PPM1A表达的BV2小鼠脑小胶质细胞系。方法针对PPM1A基因的编码序列(CDS)区,设计合成2对短发卡RNA(shRNA)序列shRNA1、shRNA2,分别将其克隆到GV493载体中,并转化至感受态大肠杆菌DH5α菌株,培养后挑取阳性克隆子进行测序,最后包装慢病毒并进行滴度测定。将2组慢病毒分别转染BV2小鼠脑小胶质细胞,并给予嘌呤霉素筛选,使用荧光显微镜及流式细胞术观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,评估转染结果,分别采用实时定量PCR和Western blot法检测PPM1A的mRNA和蛋白水平。结果 PPM1A基因shRNA慢病毒表达载体经过测序鉴定构建成功,转染BV2小鼠脑小胶质细胞后GFP表达率大于80%;与对照组相比,shRNA1及shRNA2敲低组PPM1A mRNA及蛋白水平均显著降低。结论利用慢病毒shRNA方法成功构建PPM1A敲低的BV2细胞系。

摘要：目的 设计并筛选人IGF-I有效RNA干扰片段,构建IGF-I-siRNA慢病毒表达载体.方法 对人IGF-I基因编码区分析、筛选序列4条,阴性对照序列1条.与pGCL-GFP质粒重组后,转染大肠杆菌感受态细胞.阳性克隆经过鉴定后得到正确重组子,制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒,共转染293T 细胞,体外直接感染表达IGF-I的人血管平滑肌细胞.通过用Realtime-PCR检验干扰效果.结果 ①成功地合成四条编码发夹siRNA序列的单链DNA,并将其克隆到pGCSIL-GFP载体中,构建重组质粒PscSI-1、2、3、4,及无关基因的重组质粒PscNC,酶切鉴定和测序证实载体构建成功;②Realtime-PCR检测IGF-I的mRNA表达,发现重组质粒PscSI-1转染人血管平滑肌细胞后IGF-I mRNA表达最低,重组质粒PscNC转染组细胞内IGF-I mRNA的表达量与空白对照的水平接近（P〉0.05）.结论 成功构建了小的发夹式IGF-I慢病毒表达载体.在人IGF-I序列位点1010～1028 bp、序列为ACCTTGTCTAAGTGGTTTA可以在人血管平滑肌细胞中实现对人IGF-I基因表达的有效沉默.

摘要：试验旨在构建水牛脂多糖结合蛋白(LBP)基因融合蛋白表达载体,探讨其在293细胞中的表达情况;筛选获得可抑制水牛LBP基因表达的shRNA干扰片段。采用RT-PCR方法,以水牛肝脏cDNA为模板,扩增水牛LBP开放阅读框(ORF),将其连接到pMD18-T载体中。序列测定并分析正确后,采用SalⅠ和BamHⅠ进行双酶切,将水牛LBP基因编码区定向克隆至pDsRed-N1载体中,构建其融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP。设计2个针对LBP靶基因序列的shR-NA(774-792、1212-1231),同时设计无关序列1864作为阴性对照。合成好的shRNA序列先退火连接到pUC 57载体上,再亚克隆到慢病毒表达载体pSicoR-GFP中,将重组质粒命名为pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C),采用PCR和测序方法鉴定阳性克隆。将LBP融合蛋白表达载体和其shRNA慢病毒表达载体经脂质体共转染293细胞,48h后观测荧光蛋白表达情况。收集共转染细胞样品,采用实时定量PCR(QRT-PCR)检测LBP基因的表达,筛选有效抑制LBP基因表达的shRNA干扰序列。结果表明,成功构建水牛LBP融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP,并在293细胞中瞬时表达。PCR和测序结果均证实所构建的shRNA慢病毒表达载体pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C)为阳性克隆。共转染48h后观测,红色和绿色荧光蛋白均有表达。QRT-PCR检测结果显示,shRNA-774和shRNA-1212对293细胞中LBP基因mRNA的表达均有抑制效果,抑制效率分别为49.53%、29.27%。因此,设计合成的2条shRNA序列能有效抑制水牛LBP基因的表达,这为进一步探讨LBP基因在LPS诱导的革兰氏阴性菌跨膜机制和信号转导中的作用机理研究奠定了基础。

摘要：[目的]建立稳定表达融合EGFP的人新生儿Fc受体(h FcRn)的MDCK细胞株。[方法]构建重组慢病毒质粒p EGFP-h FcRn,采用四质粒包装系统共转染HEK 293T细胞生产重组慢病毒,感染MDCK细胞后对EGFP阳性细胞进行流式单细胞分选;通过Western Blot及EGFP-β2m荧光共定位验证h FcRn的完整性,并用流式细胞仪检测h FcRn与人Ig G的结合活性。[结果]测序结果表明成功构建p EGFP-FcRn慢病毒表达载体;感染后EGFP阳性MDCK细胞比例约为26.5%,流式单细胞分选后得到纯阳性细胞;荧光共定位及Western Blot均检测到h FcRn的完整表达;流式分析表明细胞株上的h FcRn与Ig G存在p H依赖性结合。[结论]成功获得稳定表达具有生物活性的可视化h FcRn的MDCK细胞株。

摘要：目的:设计并合成生长抑素受体SSTR5基因siRNA序列,并构建其短发夹shRNA慢病毒表达质粒。方法:以小鼠SSTR5基因为靶序列,用在线软件分析、设计并合成其有效siRNA,退火形成双链DNA后,与经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切线性化慢病毒表达载体pSHR-Pμzro/GFP连接,产生pLV-shSSTR5重组慢病毒质粒,将重组质粒转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果:构建的重组表达质粒PCR产物为161bp,其中插入的SSTR5-siRNA片段为61bp,测序结果与参考序列完全一致。结论:成功构建了小鼠SSTR5基因特异性shRNA慢病毒表达质粒。