摘要：目的构建人SNCG基因短发夹干扰RNA(shRNA)慢病毒载体质粒,并观察用其转染后人子宫内膜癌HEC-1-A和Ishikawa细胞SNCG mRNA和蛋白的表达变化。方法设计3种SNCG基因特异性shRNA序列SNCGKD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3,用脂质体Lipofectamine 2000在293T细胞构建成慢病毒载体质粒。用SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3慢病毒载体质粒转染人子宫内膜癌HEC-1-A和Ishikawa细胞,用实时荧光定量PCR法检测SNCG mRNA,用Western blot法检测SNCG蛋白。结果利用AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切连接转化后的3组阳性转化子,1%琼脂糖凝胶电泳,特异条带与预计结果相符。Chromas Lite比对分析基因测序结果,鉴定结果与Gen Bank数据库一致,表明合成的3对SNCG shRNA序列SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3插入正确。HEC-1-A和Ishikawa细胞转染SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3慢病毒载体质粒后SNCG mRNA和蛋白的表达均显著降低(P均<0.05)。结论成功构建了3种SNCG shRNA慢病毒载体质粒,用其转染HEC-1-A和Ishikawa细胞后可有效沉默SNCG基因表达。

摘要：目的构建稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒及神经母细胞瘤细胞株,为进一步探讨Drp1基因在帕金森病(PD)发病过程中的作用提供细胞模型。方法于GenBank中检索人Drp1基因的核苷酸序列,设计并筛选最佳动力学参数的干扰序列及阴性对照序列;根据靶序列分别设计并合成干扰RNA(siRNA)的单链DNA寡核苷酸(DNAoligo),与退火缓冲液反应后形成带黏性末端的双链DNAoligo片段。分别用AgeⅠ与EcoRⅠ双酶切双链DNAoligo片段和GV248慢病毒骨架质粒后,加入T4DNA连接酶连接,得到重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi和阴性对照质粒。将重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi加入到大肠杆菌TOP10感受态细胞中反应后,分别提取质粒DNA并进行DNA测序。将重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi和阴性对照质粒转染至293T细胞中,培养48h后收集上清液,离心后过滤得到Drp1-RNAi重组慢病毒和阴性对照慢病毒。将人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y分为Drp1-RNAi重组慢病毒组(D组,用Drp1-RNAi重组慢病毒感染)、阴性对照组(N组,用阴性对照慢病毒感染)、正常对照组(C组,正常培养),采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞Drp1mRNA,采用Westernblotting法检测各组细胞Drp1蛋白。结果重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi的DNA序列与设计的干扰序列完全一致。D组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量为0.47±0.12和0.40±0.04,N组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量为1.12±0.33和0.67±0.05,C组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量为1.02±0.23和0.72±0.02;D组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量与N组、C组相比,P均0.05。结论成功构建了稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒,并建立、筛选出了稳定干扰Drp1基因的神经母细胞瘤细胞株,进一步探讨Drp1基因在PD发病过程中的作用提供细胞模型。