摘要：目的:构建含嵌合内含子和抗bFGF抗体基因的真核表达载体并在293T细胞中表达,探讨嵌合内含子对抗体表达的影响。方法:设计引物分别从载体pCl-neo和pComb3-Fab25中扩增出内含子和抗体Fd段、κ链基因序列,按不同组合构建到含人免疫球蛋白IgG1恒定区Fc段基因的表达载体pIgG中。重组质粒经脂质体PEI转染293T细胞,荧光显微镜观察质粒转染情况,采用夹心ELISA和Western blot检测细胞上清中抗体的表达。结果:DNA测序和酶切分析表明,内含子和抗体基因成功插入pIgG,获得了重组质粒pIgG-Fd-κ、pIgG-Fd-intron-κ、pIgG-Fd-κ-intron和pIgG-Fd-intron-κ-intron。倒置荧光显微镜下可观察EGFP大量表达,Western blot分析上清中有抗体的表达,夹心ELISA检测pIgG-Fd-κ、pIgG-Fd-intron-κ、pIgG-Fd-κ-intron和pIgG-Fd-intron-κ-intron抗体表达量分别为1.21mg/L、0.468mg/L、7.39mg/L、0.601mg/L。结论:成功构建了含嵌合内含子和抗体基因的真核表达载体并在293T细胞中得到表达。嵌合内含子插入κ链基因5′端可提高抗体的表达,插入Fd段5′端则抑制抗体的表达。

摘要：目前已发展的定点突变方法主要有盒式突变、寡核苷酸引物突变及ＰＣＲ突变等[1]。常用的ＰＣＲ定点突变法,需要四种扩增引物,共进行三轮ＰＣＲ反应,操作步骤繁琐。近来出现的ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒＰＣＲ方法[2]克服了这一缺点。我们设计了三条引物,建立了ｍｅｇａｐｒｉｖ...

摘要：目的获得抗人大肠癌单抗CAb-1重链可变区VH的准确基因。方法结合生物信息学同源比较分析,利用高兼并的FR15′端处引物扩增的单抗CAb-1的VH基因,并与数据库中序列比对,在同源性最高的抗体序列的信号肽处二次设计引物,用RT-PCR法获得抗体基因VH的准确序列。结果选定了与已知抗体VH高度同源的序列进行引物设计。凝胶电泳可见预期大小DNA条带。经测序表明,配对于信号肽处的扩增产物不仅与配对于抗体可变区FR1的结果一致,而且也纠正了配对于CAb-1的VH的FR1的兼并引物所引入的氨基酸突变。结论所优化设计的引物能够扩增完整的抗人大肠癌单抗CAb-1重链可变区基因,为小分子工程抗体改造奠定了基础。