摘要：背景：前期实验已证实骨髓间充质于细胞表面存在整合素受体，但血管生成素1是否能通过整合素受体促进骨髓间充质干细胞的生存、抗凋亡目前尚不明确。目的：探讨血管生成素1对大鼠骨髓间充质干细胞黏附、活力、抗凋亡的影响，并初步分析其信号转导机制。设计、时间及地点：细胞学体外对照观察，于2008—01/10在厦门大学附属中山医院开放实验室完成。材料：清洁级SD大鼠40只，由中科院上海实验动物中心提供。人血管生成素1为R＆D公司产品。方法：密度梯度离心结合贴壁分离法体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞，第346代细胞用于实验。分别以不同的基质包被24孔培养板1h，清洗后再加入单细胞悬液，设立7组：第1组作为对照，以含0．1％牛血清白蛋白的PBS包被；第2-4组分别以玻粘连蛋白、纤维粘连蛋白、血管生成素1包被；第5-7组单细胞悬液预先分别与乙二胺四乙酸、β1抗体、RGD抗体孵育10min后再加入24孔板，行血管生成素1包被。主要观察指标：通过黏附测定、锥虫蓝染色、MTT试验、Hoechst染色和AnnexinV／PI法检测血管生成素1对骨髓间充质干细胞的黏附、活力、抗凋亡等生物学效应，结合整合索抗体和信号转导阻滞剂通过Western blotting法检测磷酸化丝氨酸，苏氨酸蛋白激酶B、总丝氨酸，苏氨酸蛋白激酶B、Bcl．2和B-actin水平。结果：成功分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，流式细胞仪鉴定其纯度达98．3％。黏附试验显示与对照组比较，培养1，2，3d血管生成素1均能促进骨髓间充质干细胞的黏附（P〈0．01），该效应能被乙二胺四乙酸、整合索亚单位B1抗体和RGD抗体所抑制（P〈0．01）。血管生成素1能促进骨髓间充质干细胞在血清饥饿下的存活（P〈0．01）、增殖（P〈0．01）和提高磷酸化丝氨酸，苏氨酸蛋白激酶B、Bcl-2的表达来拮抗紫杉醇诱导的凋C（P〈0．01），RGD抗体能抑制上述作用。结论：血管生成素1可与整合素受体结合促进骨髓间充质干细胞的黏附、存活和增殖，并通过上调磷酸化丝氨酸，苏氨酸蛋白激酶B和Bcl-2的表达发挥抗凋亡作用。

摘要：TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和抗细胞凋亡功能。由于新城疫病毒(NDV)引起细胞死亡是通过诱导凋亡产生,所以提高宿主细胞的抗凋亡水平,有助于延长细胞存活时间进而提高子代病毒的滴度。本研究根据GenBank中预测仓鼠TIGAR基因和鸡TIGAR基因设计引物,分别扩增仓鼠和鸡的TIGAR基因,并构建各自的慢病毒包装质粒,以适合NDV增殖的BHK-21细胞为基础构建稳定过表达TIGAR细胞系(BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR)。使用Western blot、DNA测序和qPCR对TIGAR基因表达水平进行鉴定,Western blot和流式仪检测细胞的自然凋亡率。选取新城疫病毒强中弱3种毒株分别感染构建的细胞系,测定病毒滴度。结果显示:重组细胞系BHK-21-chTIGAR细胞和BHK-21-hamTIGAR细胞经过Western blot和DNA测序等检测表明构建成功,TIGAR基因表达量高且无野生型BHK-21细胞污染。qPCR检测细胞系的稳定性结果显示,TIGAR基因在BHK-21细胞中经过30次传代均可稳定表达。Western blot和流式细胞检测结果显示:BHK-21-hamTIGAR细胞的凋亡率低于野生型BHK-21细胞和BHK-21-chTIGAR细胞;病毒生长曲线结果显示:强毒株ZJ1病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID50(5.67,72 h)高于BHK-21-chTIGAR细胞(5.53,72 h)和野生型BHK-21细胞(5.27,72 h);中强毒株SH15病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID50(4.90,96 h)要高于BHK-21-chTIGAR细胞(4.57,96 h)和野生型BHK-21细胞(4.67,96 h);弱毒株LaSota病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID50(4.07,96 h)要高于BHK-21-chTIGAR细胞(3.90,96 h)和野生型BHK-21细胞(3.77,96 h)。综上所述,所构建的BHK-21-hamTIGAR细胞系具有明显的抗凋亡功能,且有利于新城疫病毒的高水平复制,有望进一步开发完善成为新城疫病毒疫苗生产所用的细胞株。