摘要：【目的】了解志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的分布及其与毒力和耐药的关系,并分析志贺菌中插入序列IS600对CRISPR相关蛋白基因cse2 m RNA表达水平的影响。【方法】利用课题组前期设计的引物PCR扩增志贺菌的3个CRISPR位点、CRISPR相关蛋白基因cse2、耐药基因和毒力基因;改良Kirby-Bauer(K-B)纸片法进行药敏试验;台盼蓝计数试验检测细菌毒力;Real-time PCR检测志贺菌中cse2基因m RNA表达水平。分别分析志贺菌中CRISPR/Cas系统与耐药基因、耐药表型、毒力基因、毒力表型的关系;了解IS600对CRISPR相关蛋白基因cse2 m RNA表达水平的影响。【结果】志贺菌中CRISPR1位点阴性细菌的毒力强;插入序列IS600使cse2 m RNA表达水平降低。【结论】志贺菌中存在CRISPR1、2、3位点;CRISPR1位点与毒力有关;插入序列IS600对cse2 m RNA表达水平有影响。

摘要：【目的】在大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655-ΔrecA和Escherichia coli DH10B中构建CRISPR/LshCas13a质粒干扰系统,通过靶向非必需基因lacZ和必需基因polA,分别分析RNA编辑实验中的逃逸现象。【方法】选取来自沙氏纤毛菌(Leptotrichia shahii)中的Cas13a蛋白编码基因LshCas13a,构建可诱导的CRISPR/LshCas13a的RNA编辑系统相关质粒,选取MG1655-ΔrecA和DH10B为研究对象。通过Crisporo算法,设计靶向lacZ和polA的CRISPR RNA(crRNA)序列,考察利用LshCas13a质粒干扰实验靶向lacZ和polA的逃逸现象。再通过对逃逸菌落的数量和序列分析评估LshCas13a系统的逃逸现象,结合PCR和Sanger测序技术探究LshCas13a系统的逃逸事件。选取通过插入序列(insertion sequence,IS)转座破坏LshCas13a系统的LshCas13a基因的逃逸菌落,通过监测OD_(600)进一步考察菌株的生长情况。【结果】利用LshCas13a系统靶向MG1655-ΔrecA和DH10B中的lacZ和polA,发现靶向lacZ时,MG1655-ΔrecA通过LshCas13a基因点突变和IS转座突变方式逃逸;靶向polA时,MG1655-ΔrecA和DH10B通过点突变LshCas13a基因、IS转座和突变crRNA的直接重复(direct repeat,DR)序列等方式逃逸。LshCas13a编码基因的突变促进了菌株生长的恢复。【结论】本研究利用LshCas13a质粒干扰系统研究了***宿主RNA编辑中的多样化逃逸现象,包括了染色体编码的IS介导的LshCas13a转座突变、LshCas13a点突变、crRNA的DR序列突变或重组等情况。本研究为进一步优化CRISPR/LshCas13a基因编辑系统奠定了基础。

摘要：目的　研究布氏田鼠鼠疫菌株 1 0 2kbpgm基因座结构与其他类型鼠疫菌是否有区别 ,及其与布氏田鼠鼠疫菌株的独特特征的关系。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)的方法 ,共设计 2 5对嵌套的引物 ,以喜玛拉雅旱獭鼠疫菌株和布氏田鼠鼠疫菌株的染色体DNA为模板 ,分段扩增该区域内的DNA ,选择差异较大的扩增片段进行克隆和测序 ,与已发表的序列比较。结果　布氏田鼠鼠疫菌株的 1 0 2kbpgm基因座一端缺失了1 952个碱基 ,即插入序列IS1 0 0。另外 ,在测序的这段基因中 ,一类似于可变数量串联重复序列 (VNTR)的区域 ,布氏田鼠鼠疫菌比已发表的序列多出几个拷贝。结论　布氏田鼠鼠疫菌株的 1 0 2kbpgm基因座序列改变了 ,一端缺失了插入序列IS1 0 0 ,这就使得它的毒力岛不容易丢失 ,保持了 pgm+表现型的稳定 ;与其毒力的关系 。

摘要：　　采用新型TaqMan-MGB探针建立贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR检测方法.根据贝氏柯克斯体特异的23S插入序列设计引物和探针,将PCR扩增的插入序列连接到T载体质粒,该重组质粒用作参比模板来建立方法.用建立的实时荧光定量PCR检测倍比稀释的参比模板,其敏感性是套式PCR检测方法的1000倍.用其它立克次体的DNA作对照模板,该定量PCR显示高度贝氏柯克斯体特异性.用建立的实时荧光定量PCR检测感染小鼠脏器样本,在小鼠的脾脏、肝脏样本中检测到贝氏柯克斯体,检测到的贝氏柯克斯体的量与感染的过程有线性关系.本研究建立的贝氏柯克斯体实时荧光定量PCR检测方法具有比普通PCR检测方法更好的特异性和更高的敏感性,其定量检测的特性特别适合对贝氏柯克斯体感染程度的评价,以及对Q热疫苗的免疫保护效果的评价.……

摘要：目的了解鲍曼不动杆菌OXA型碳青霉烯酶基因型的存在状况。方法应用聚合酶链反应(PCR)检测OXA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-58基因,对PCR产物进行DNA直接测序,同时采用PCR对ISAba1和ISAba3插入序列进行检测,对PCR产物进行直接测序。除分别对OXA-23和ISAba1进行检测外,在两个基因之间再设计一对引物进行扩增,获得ISAba1与OXA-23之间的全长DNA序列。结果收集温州医科大学附属第一医院住院患者临床分离的200株鲍曼不动杆菌,用PCR方法共检到OXA-23基因阳性菌株155株,阳性率为77.5%,其中与插入序列ISAba1同时阳性143株,阳性率为71.5%,本次试验未检到OXA-24基因阳性菌株;200株鲍曼不动杆菌均携带OXA-51基因,阳性率为100%,其中和OXA-23基因同时阳性155株,阳性率为77.5%;OXA-58基因阳性菌株共检出8株,阳性率为4.0%,插入序列ISAba3阳性共检出12株,阳性率为6.0%,其中有8株ISAba3和OXA-58同时阳性,阳性率为4.0%。结论产OXA-23型碳青霉烯酶是该院鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗生素的主要原因。