摘要：旨在建立检测猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus 1,FHV-1)、猫杯状病毒(Feline calicivirus, FCV)、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)多重TaqMan荧光定量PCR方法。基于FHV-1的胸苷激酶(TK)基因、FCV的衣壳蛋白VP1基因、Bb的皮肤坏死毒素基因(DNT1)序列保守区域设计并合成TaqMan荧光定量PCR引物和探针,以FHV-1、FCV、Bb、猫细小病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌为模板验证引物和探针的特异性。制备重组质粒pMD18T-FHV-TK、pMD18T-FCV-VP1、pMD18T-Bb-DNT1作为标准品,经矩阵法确定最佳反应体系。以10倍梯度稀释的标准品为模板检测方法的灵敏性。应用建立的方法对32份临床具有上呼吸道感染症状的猫眼、口、鼻拭子检测,以评估该方法的可行性。结果显示:该方法可特异性检出FHV-1、FCV、Bb,且与猫细小病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌无交叉反应;灵敏度试验表明该方法对FHV-1、FCV、Bb的最低检出限分别为10、10和100拷贝/μL;应用该方法从32份猫临床样品中检测出FHV-1阳性11份、FCV阳性21份、Bb阳性4份,并经PCR测序验证。本研究初步建立了FHV-1、FCV、Bb多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,具有特异性强、敏感性高的特点,为临床猫上呼吸道疾病病原的分子检测提供参考。

摘要：为建立支气管败血波氏杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,本研究根据波氏菌属毒力基因DNT设计一对特异性引物,通过优化,确定最佳反应条件,建立了支气管败血波氏杆菌荧光定量PCR检测方法。并对其进行敏感性、特异性、重复性试验以及临床样品的检测。以支气管败血波氏杆菌标准质粒为模板,建立标准曲线结果显示:标准品浓度在1.13×10~8拷贝/μL～1.13×10~2拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,相关数R^2=0.997;该方法的灵敏度可达1.13×10~1拷贝/μL。建立的荧光定量PCR方法与副猪嗜血杆菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌等12种细菌和伪狂犬病毒、猪瘟病毒等4种病毒无交叉反应,具有良好的特异性;批内变异系数(CV)均小于2%,批间变异系数均小于4%,具有良好的稳定性。对临床样品的检测结果显示该方法检测的阳性率为57.7%,与普通PCR的符合率为93.24%。本研究建立的方法可以用作支气管败血波氏杆菌感染的早期诊断、快速检测与定量分析。

摘要：根据支气管败血波氏杆菌ptxA基因设计1对引物,扩增特异的872bp核酸片段,建立了应用PCR检测支气管败血波氏杆菌的方法。特异性试验结果表明,3株支气管败血波氏杆菌参考菌株均能扩增出872bp特异性的核酸片段,兔源性的大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,PCR的最低检出限量为210个支气管败血波氏杆菌。利用建立的PCR检测方法对22株从山东省泰安地区某兔场采集的疑似兔支气管败血波氏杆菌病病兔鼻黏液棉拭子进行检测,结果19株为阳性。并同时进行普通血清学方法和细菌学方法,对检测结果进行了比较,结果显示,PCR方法阳性检出率高于其他检测方法。

摘要：参照GenBank上支气管败血波氏杆菌的菌毛fimD基因序列(X75811),设计1对引物,从本实验室分离鉴定的猪源支气管败血波氏杆菌中扩增出fimD编码区1 098 bp的片段,将其克隆至原核表达载体pET-28a,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行融合表达。SDS-PAGE和Western blot检测证实该表达产物以包涵体形式存在,大小约42 ku,与用支气管败血波氏杆菌菌体制备的阳性血清能发生特异性反应。将包涵体变性和复性后包被酶标板建立间接ELISA(fimD-ELISA),特异性良好。用fimD-ELISA检测临床送检的668份血清,阳性率为30.7%。用该法与微量凝集试验平行检测102份血清,fimD-ELISA的敏感性高于微量凝集试验。

摘要：根据支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)鞭毛蛋白基因的上游序列设计了1对引物fla1和fla2,扩增出大小为237 bp的目的基因片段,建立了快速检测支气管败血波氏杆菌的PCR方法。特异性和敏感性试验表明,该方法对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和D型多杀性巴氏杆菌均无交叉性反应;最低能够检出112.5 pg的模板DNA。用该PCR法检测了从延边州采集的48份表现不同临床症状的猪鼻黏液;结果,检出支气管败血波氏杆菌阳性42例,阳性率为87.5%。同时与传统的细菌检查法、微量凝集法进行了比较;结果显示,该PCR法的检出率是细菌检查法的5.25倍,是微量凝集法的1.75倍。

摘要：根据支气管败血波氏杆菌菌毛蛋白基因(fimN)序列设计了一对引物,扩增出大小为648bp的目的基因片段,建立了快速检测兔支气管败血波氏杆菌的PCR方法。特异性和敏感性试验表明,该方法对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和巴氏杆菌均无交叉性反应。用该PCR法检测了从杨凌、咸阳采集的50份表现临床症状的兔呼吸道分泌物检出支气管败血波氏杆菌阳性35例,阳性率为70%。同时与传统的细菌检查法、微量凝集法进行了比较,结果显示,该PCR法的检出率是细菌检查法的3.89倍,是微量凝集法的1.94倍。

摘要：为建立同时检测兔金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌的双重PCR检测方法,本研究根据金黄色葡萄球菌的nuc基因和支气管败血波氏杆菌的fimN基因的保守序列设计2对特异性引物,通过优化反应条件,成功建立兔金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌双重PCR检测方法。该方法对兔多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和魏氏梭菌的检测结果为阴性;能够检出5pg的金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌的基因组DNA;与单重PCR检测方法的符合率为100%。说明本试验建立的双重PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和准确性,为兔金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌的鉴别诊断提供了有效的技术手段。

摘要：根据支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)鞭毛蛋白基因的上游序列设计1对引物Fla1和Fla2,采用菌落PCR方法扩增目的基因片段来检测支气管败血波氏杆菌。利用该方法成功的从8株支气管败血波氏杆菌中扩增出237bp左右的特异性目的片段。特异性试验表明,该方法对大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪链球菌和副猪嗜血杆菌均无交叉性反应。灵敏性试验表明,将单个菌落稀释105倍,利用此菌落PCR仍能扩增到相应的目的片段。结果表明建立的菌落PCR方法对支气管败血波氏杆菌的检测敏感性高、特异性强,可用于Bb感染的诊断和流行病学调查。

摘要：为研究猪源性支气管败血波氏杆菌外膜蛋白OmpQ的功能及免疫原性，本研究参照GenBank中支气管败血波氏杆菌S798株的外膜蛋白OmF·Q基因序列设计引物，通过PCR扩增技术获得OmpQ基因，测序后进行同源性分析，并将其克隆至pET-28a（＋）载体，构建重组质粒pET-OmpQ，转化大肠杆菌Transetta（DE3），经IPTG诱导表达纯化目的蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体，Western blot分析其免疫原性。结果显示，表达蛋白相对分子质量大小约为36000，且以包涵体的形式存在。间接ELISA和Western blot结果表明，表达产物具有较好的免疫原性。研究结果为支气管败血波氏杆菌外膜蛋白OmpQ的后续生物学功能研究奠定基础，并为支气管败血波氏杆菌的快速诊断提供数据支持。

摘要：本试验旨在了解近年来浙江省兔支气管败血波氏杆菌的感染情况及耐药状况,指导合理用药,检测细菌的耐药基因,探究其耐药机理。根据细菌形态、培养特性、生化试验,结合PCR法对分离菌株进行鉴定;K-B纸片扩散法检测细菌对18种常用抗生素的耐药率;设计耐药基因特异性引物,PCR法扩增耐药基因,并进行测序分析。结果显示,分离鉴定出2012—2014年22株兔支气管败血波氏杆菌;药敏结果显示,分离菌对青霉素G、头孢拉定、链霉素、林可霉素、克林霉素、甲氧嘧啶耐药严重,对多黏菌素B、左氟沙星、强力霉素、四环素等药物敏感,耐β-内酰胺类药物的细菌中检测到耐药基因blaTEM。结果表明,兔支气管败血波氏杆菌是引起兔呼吸道疾病的主要病原菌,分离菌多重耐药,耐药率较高,检测到的耐药基因与耐药表型相符。