摘要：目的建立幽门螺杆菌(Hp)数字pcr检测体系,为Hp诊断提供一个精准、灵敏的定量检测方法。方法根据Hp 16S rRNA序列设计特异性引物和探针,采用质控菌进行特异性检验;以梯度稀释的DNA为模板,评估检测灵敏度;采用不同浓度的模板进行多重复检测,评估检测精密度;以梯度法设置引物浓度和退火温度,对数字pcr反应条件进行优化。结果所设计的引物和探针可特异性地检测Hp 16S rRNA基因,不受大肠杆菌等细菌干扰;该方法的最佳反应温度为57.1℃,最佳引物浓度为550 nmol/L;该体系的检测限为0.35 copies/μL,检测变异系数CV<10%,浓度梯度线性分析的拟合度R^(2)=0.9968。结论本研究建立的Hp数字pcr检测体系,具有特异、灵敏和精密度高的特点。

摘要：旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)微滴式数字pcr(droplet digital pcr,ddpcr)定量检测方法。本研究根据GenBank登录的PEDV(MK862249.1)M基因序列保守区设计合成特异性引物对和探针;通过对反应体系和反应条件的优化,成功建立了可用于检测PEDV的荧光定量pcr(fluorescent quantitative real-time pcr,FQ-pcr)方法,将自行建立的FQ-pcr方法的引物对/探针用来确定ddpcr方法;对ddpcr方法进行敏感性、特异性、重复性和初步应用试验。结果显示:自行建立的FQ-pcr方法在敏感性、重复性等方面均优于行标FQ-pcr方法;根据自行设计的FQ-pcr方法建立的ddpcr方法最低检测极限为0.15 copies·μL^(-1),敏感性高于行业标准(SN/T 1699—2017)FQ-pcr方法(1.0×10^(1)copies·μL^(-1));模板浓度为1.0×10^(0)~1.0×10^(4)copies·μL^(-1)时,具有良好的线性关系(R 2>0.99);批内、批间变异系数(CV%)为1.52%~7.40%;对猪丁型冠状病毒、猪伪狂犬病毒等11种对照病毒核酸检测结果均为阴性;分别用建立的ddpcr方法、行业标准FQ-pcr方法对150份临床样品进行PEDV核酸检测,ddpcr方法对行业标准FQ-pcr方法检测阳性样品的检测符合率为10^(0)%。本研究成功建立的PEDV ddpcr检测方法可用于临床上PEDV感染的早期检测和定量检测,为PEDV核酸标准物质的研制提供了定量手段。

摘要：为建立病毒性出血性败血症病毒精准快速检测方法,以病毒性出血性败血症病毒基因组特异保守的糖蛋白基因片段为靶目标,设计合成了特异性引物及探针,优化退火温度等关键反应条件,分别进行灵敏性试验、特异性试验及重现性试验,构建病毒性出血性败血症病毒数字pcr检测技术体系,同时,与实时荧光定量RT-pcr方法进行对比分析。试验结果显示,病毒性出血性败血症病毒数字pcr最佳退火温度为58.5℃。灵敏性试验显示,随着病毒性出血性败血症病毒基因组RNA连续10倍稀释,稀释至105倍数时,数字pcr体系仍可以检测到阳性微滴,因此,确定RNA基因组核酸含量19拷贝/μL为病毒性出血性败血症病毒数字pcr的检测低限。特异性试验表明,该方法只与目标病毒——病毒性出血性败血症病毒有特异性扩增,与传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、流行性造血器官坏死病毒、牙鲆弹状病毒、病毒性神经坏死病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤浮肿病毒、真鲷虹彩病毒、淋巴囊肿病毒等10种病毒均无扩增反应。重复性试验结果表明,病毒性出血性败血症病毒数字pcr批内与批间试验的变异系数均小于1%,具备良好的重复性。利用构建的数字pcr方法,对收集到的国内及进境鱼类样品共计1210批次进行病毒性出血性败血症病毒检测,结果显示,数字pcr阳性样本检出率为9.5%,常规实时荧光定量RT-pcr阳性样本检出率为7.69%~7.77%。临床试验结果表明,研究建立的病毒性出血性败血症病毒数字pcr方法较常规技术具有更高的检测灵敏性,适用于水生动物疫病精准检测的需求。

摘要：建立幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)毒力基因数字pcr检测体系,为Hp诊疗提供一个精准、灵敏的毒力定量检测方法。根据Hp毒力基因vacA和cagA的序列设计特异性引物和探针,采用质控菌评估检测特异性;以梯度法设置引物浓度和退火温度,对反应体系及反应条件进行优化;以梯度稀释的DNA为模板,评估检测灵敏度;采用不同浓度模板开展重复性检测,评估检测精密度。结果显示,所设计的引物和探针可特异性地检测vacA和cagA基因,不受大肠杆菌等细菌干扰。vacA和cagA基因的最佳反应温度分别为55.0℃和57.9℃,最佳引物工作浓度分别为650 nmol/L和550 nmol/L,线性分析的拟合度R^(2)分别为0.9991和0.9995,不同浓度样品的变异系数(CV)值均小于10%。本研究建立的Hp毒力基因vacA和cagA数字pcr检测体系具有特异、灵敏和重复性好等优点,可为Hp病理诊疗和科学研究提供精准、可靠的技术支持。

摘要：大像面荧光显微成像系统可以对大尺寸dpcr生物基因芯片进行一次性成像,但其景深(DOF)较小,限制了系统的物方检测深度。文章采用波前编码技术在不降低分辨率的前提下,有效扩展了大像面荧光显微成像系统的景深,为后续高通量多层堆叠式dpcr生物芯片实现一次性成像提供了技术支持。但考虑到显微成像系统正向设计仿真时不适合直接进行景深延拓分析,故对其倒置翻转后在像方(原物方)分析焦深延拓范围(即景深)。为确定最优的相位板参数值,编写遗传算法与ZEMAX的API接口链接,以动态交互的方式对相位板调制系数进行优化、筛选、定值。在大像面荧光显微成像系统孔径光阑前的平行光路处添加特定系数的相位板,对光学系统的波前相位进行调制,使得在焦点附近一段范围内产生成像一致的中间模糊像。采用维纳滤波对中间模糊像进行复原,由模拟的结果可见,在传统光学系统的±10倍景深内,编码复原图像具有较高的分辨率(达到6.5μm),能够实现系统的景深延拓。装配相位板的大像面荧光显微成像实际系统,其延拓倍数在±7倍景深范围内有较好的图像复原分辨率(6.5μm)。

摘要：目的:利用数字pcr(dpcr)技术检测重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)产品中质粒DNA残留。方法:针对质粒抗性基因KanR序列的4个不同区段设计引物探针,建立单重和双重dpcr检测KanR残留量;在双重dpcr中,双阳性孔代表2组引物对之间的序列完整,通过测试单、双阳性孔的比例,评价KanR序列的分布情况;利用DNaseⅠ消化游离的质粒DNA,评价病毒衣壳内错包装的质粒DNA情况。结果:4组单重dpcr实测KanR残留量之间基本一致(1.054×10^(8)~1.467×10^(8)copies·μL^(-1));双重dpcr与单重dpcr实测结果间无明显差异;双重dpcr在6~6 000 copies·μL^(-1)浓度范围内显示出良好的线性关系(r>0.999)和重复性(RSD<20%);1/2,2/3和3/43种组合的双重pcr的双阳性孔占比基本一致,表明KanR基因的断裂可能更趋向于随机断裂;DNaseⅠ处理前后结果提示,错包装的大片段质粒DNA(1/4双阳性)比游离的占比更高。结论:dpcr技术可用于检测rAAV产品中质粒DNA残留量,多重dpcr还可评估质粒DNA片段大小及分布情况。

摘要：本研究拟建立检测CK19基因表达的数字pcr(digital pcr,dpcr)方法并测试其性能,以期利用该方法的超高敏感性和绝对定量优势进行循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTC)的定量分析。首先,根据CK19基因的mRNA序列进行引物探针设计,以看家基因ABL1作为内参,采用人乳腺癌MCF7细胞和健康人白细胞从13套引物探针之中筛选出了最佳的引物探针,测序结果证实扩增序列无误。其次,针对选定的引物探针进行反应条件的优化,以不同浓度的健康人白细胞cDNA为模板进行空白检测限(limit of blank,LOB)的分析,证实当ABL1基因拷贝数为20,000、15,000、10,000、5000、2500时,CK19的LOB分别为9.24、8.93、3.12、3.17和2.53拷贝。再次,采用MCF7细胞和健康人白细胞的cDNA模板进行不同浓度预混的检测限(limit of detection,LOD)分析,证实50%、10%、5%、1%、0.5%和0.1%的浓度配比下均可以有效检出CK19基因,线性R2值为0.9998。最终,临床样本的数字pcr检测结果发现晚期乳腺癌患者的CK19拷贝数高于健康人对照。上述结果说明本研究所建立的检测CK19基因的数字pcr方法具有敏感、特异和定量准确等优势,未来经过进一步验证之后有望用于乳腺癌的CTC定量分析,具有良好的应用前景。

摘要：由于世界卫生组织(WHO)将B.1.1.7(Alpha)列为“关切的变异株”,因此对其建立特异性的高灵敏数字pcr方法尤为重要。该方法需首先根据该变异株刺突蛋白的H69/V70缺失、P681H和A570D 3个特异突变位点设计引物探针,确定3个方法的线性范围和定量限;随后再用其他4个“关切的变异株”验证该方法的特异性,并用不同数字pcr平台和不同方法进行定量准确性的比较;最终,结果表明建立的数字pcr方法准确可靠,可用于B.1.1.7变异株的定量检测。

摘要：为建立一种特异性强、灵敏度高、重复性好的非洲猪瘟病毒(ASFV)检测方法,根据ASFV保守区域设计引物探针,在荧光pcr检测方法的基础上,建立了检测ASFV的微滴数字pcr方法,对其特异性及线性关系进行评估,以阴性样品和低拷贝样品分别测定该方法的空白检测限(LOB)和最低检测限(LOD)。结果显示:该方法有较好的线性关系(R2=0.999),与其他6种猪常见病毒及5种动物组织无交叉反应,LOB为1.6 copies/μL,LOD为3 copies/μL。利用建立的数字pcr、C1荧光pcr,以及世界动物卫生组织(WOAH)提供的荧光pcr和常规pcr方法对50份不同来源的样品进行检测,结果表明,建立的ASFV数字pcr检测方法具有高效、特异、灵敏等特点,可用于非洲猪瘟监测和口岸动物疫病防控。

摘要：为了建立灵敏、特异的H7亚型禽流感病毒(AIV)微滴式数字pcr(ddpcr)检测方法,本研究根据GenBank和GISAID中H7亚型AIV血凝素(HA)基因的核苷酸序列,设计合成H7亚型AIV的引物和探针,对反应条件进行优化,从而建立检测H7亚型AIV的ddpcr方法,并测定其特异性、敏感性和重复性。结果显示,最佳引物浓度和探针浓度分别为900 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度为55℃,最佳升降温速率为2.0℃/s,最佳反转录时间为20 min。特异性试验结果显示,该方法仅对H7亚型AIV进行特异性检测,对H5亚型AIV、H9亚型AIV、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒均不能检出。敏感性试验结果显示,该方法对重组质粒标准品检测下限为0.8 copies/μL,比荧光定量pcr(qpcr)方法敏感性高10倍。组内和组间重复性试验结果显示,变异系数均小于3%。对60份临床样品检测显示,该方法与鸡胚分离方法的符合率为100%。结果表明,本研究建立的H7亚型AIV ddpcr检测方法具有较好的特异性、重复性和敏感性,可用于H7亚型AIV的早期诊断、流行病学调查、诊断方法评估、标准物质研制、免疫效果评估,为H7亚型AIV的科学防控和研究提供了有力的技术储备。