摘要：【目的】构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO),研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)复制的影响。【方法】根据MLKL序列设计特异性编辑位点,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体,转染至PK-15细胞,经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系,通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平;采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平;采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】试验成功构建MLKL-sgRNA载体,筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株,Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比,PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH(感染后36 h除外)和PRV Bartha-K61的病毒滴度(P<0.01;P<0.05)。PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO细胞后,坏死细胞明显减少。【结论】本研究构建了MLKL基因敲除的PK-15细胞株,与PK-15细胞相比,PK-15 MLKL-KO细胞显著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的复制和存活能力,为PRV Bartha-K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了一种可行性策略。

摘要：目的:构建CRISPR/Cas9介导下泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system,UPS)-E3泛素连接酶(atrophin 1interacting protein 4,ITCH)基因敲除细胞株。方法:在人ITCH基因的PAS结构域内设计3个sgRNA,构建3个分别同时表达ITCH-sgRNA、Cas9和eGFP的三合一质粒。经测序序列正确的重组质粒用lipofectamine 3000转染HeLa细胞,24h后荧光倒置显微镜观察转染情况。结果:3个ITCHsgRNA寡核苷酸单链成功退火成为双链,经测序发现,设计的3个ITCH-sgRNA全部重组到了CRISPR/Cas9载体上。荧光检测发现在同时表达ITCH-sgRNA、Cas9和eGFP的三合一质粒转染的HeLa细胞内有绿色荧光。结论:成功构建了同时表达ITCH-sgRNA、Cas9和eGFP的三合一质粒,并将三合一重组质粒成功转入细胞中,为实现在HeLa细胞中完全敲除ITCH基因,从而为构建ITCH基因敲除稳定株奠定了基础。

摘要：为研究miR-155基因在猪肺泡巨噬细胞系(3D4/21)中的功能,采用CRISPR/Cas9系统构建miR-155敲除的猪肺泡巨噬细胞系。首先,采用sgRNA-cas9程序,设计4个靶向miR-155的特异性sgRNA引物序列。然后构建sgRNA表达载体,与pEGFP-C1-cas9载体共转染3D4/21细胞,进行流式分选并富集表达绿色荧光蛋白GFP的细胞。最后,采用T7E I酶酶切、Sanger测序、实时荧光定量PCR(qPCR)、western blot等方法检测敲除效率,发现miR-155基因可以被以上4个sgRNA编辑,其中sgRNA39的敲除效率最高,T7E I酶酶切检测流式分选后的敲除效率有42%;Sanger测序显示sgRNA39细胞系敲除31个碱基;RT-qPCR结果显示miR-155-5p/3p表达量均有下降;western blot结果表明miR-155靶基因SHIP1的蛋白表达量升高。成功构建miR-155敲除的3D4/21细胞为进一步探讨miR-155在巨噬细胞发挥的调控功能研究提供细胞模型。

摘要：旨在利用CRISPR/Cas 9新型基因编辑技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统,并分析其对不同大肠杆菌aroA基因敲除、修复的差异。首先构建靶向aroA基因的CRISPR/Cas 9载体;随后人工设计同源修复供体基因序列,并亚克隆到CRISPR/Cas 9载体中,构建成完整的CRISPR/Cas 9基因敲除体系;将该系统分别应用到大肠杆菌DH10B、DH5α和JM109细胞中,PCR鉴定筛选到的阳性菌株,并回收其扩增条带进行克隆、测序。CRISPR/Cas 9载体的酶切与测序结果均正确,表明载体构建成功;PCR鉴定结果显示,该系统对三种大肠杆菌均能进行aroA基因的有效敲除,敲除效率为46%~58%;测序结果进一步证实目的基因敲除成功。本试验成功构建大肠杆菌aroA基因CRISPR/Cas 9敲除系统,为进一步研究致病菌aroA基因功能及开发减毒大肠杆菌疫苗提供新型、有效的基因敲除工具。

摘要：大肠杆菌的tna A基因编码色氨酸酶,该基因的失活有利于大肠杆菌积累更多的L-色氨酸。利用CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术对大肠杆菌tna A基因进行敲除。首先针对tna A基因设计CRISPR/Cas9作用靶点,构建gRNA表达质粒;随后人工设计同源修复供体基因序列,构建成完整的CRISPR/Cas9基因敲除系统;将该系统应用到大肠杆菌w3110-Δ中,经PCR和测序鉴定,证实目的基因tna A敲除成功,敲除效率75%。成功构建了大肠杆菌tna A基因敲除菌,为大肠杆菌L-色氨酸高产菌株的构建奠定了基础。

摘要：本研究旨在对水牛anti-silence factor 1a (asf1a)基因进行克隆并行生物信息学分析,并进一步筛选基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的高效敲除asf1a基因位点。根据NCBI公布的牛asf1a基因mRNA序列设计特异性引物,以水牛GV期卵母细胞RNA反转录后的cDNA作为模板,通过PCR技术克隆获得asf1a基因序列片段,利用生物信息学分析方法,对克隆得到的序列进行和相应翻译的蛋白质进行了分析。在克隆得到的水牛asf1a基因序列上筛选3个PAM位点,并根据PAM位点构建3个gRNA载体(g1、g2、g3)以及相应的RGS载体,将pcDNA3.1-h Cas9连同gRNA、RGS 3种质粒按照3∶1∶1比例共转293T细胞,筛选高效的CRISPR/Cas9敲除位点。试验以水牛GV期的卵母细胞RNA作为模板,通过RT-PCR技术克隆获得asf1a基因序列,并据测序结果设计靶向区域筛选高效asf1a基因敲除位点。结果发现,水牛asf1a基因CDS区全长615 bp,编码204个氨基酸;多重序列分析显示,水牛asf1a基因核苷酸序列与黄牛、绵羊、猪、人、小鼠同源性分别达到了99%,98%,97%,96%,93%;蛋白质结构预测分析发现存在ASF1-hist-chap等结构,二级结构含有9个α螺旋、12个β折叠、14个T转角、14个无规则卷曲。系统进化树分析表明,水牛和黄牛亲缘性最接近。根据水牛asf1a设计的敲除载体转染293T和成纤维细胞后,细胞基因组进行T7E1酶切的结果表明,g1位点对水牛成纤维细胞敲除效率最高,达到93.82%,同时,sanger测序表明效率达17/20。本研究成功克隆了水牛asf1a基因和分析了其生物学信息,同时筛选出了asf1a的高效敲除位点,为研究水牛asf1a基因功能奠定基础。

摘要：背景与目的:CNC-bZIP是核转录因子E2相关因子2[nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2,NRF2]近羧基端一个亮氨酸拉链结构,该区域是DNA结合以及NRF2与小分子肌腱纤维肉瘤(small masculoaponeurotic fibrosarcoma,sMaf)蛋白结合形成二聚体所必需的区域,随后该区域与抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)结合,激活NRF2下游靶基因的转录表达,从而增加细胞抗氧化应激能力。构建CRISPR/Cas9慢病毒系统,获得了A549细胞中NRF2基因稳定敲除株并进行了功能研究。方法:针对该结构上下游设计一对sgRNA,与pLenti CRISPR v2载体连接,通过包装慢病毒的方式构建A549稳定敲除细胞系。根据测序图谱及蛋白质印迹法(Western blot)验证敲除效果。然后通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)、Western blot检测、克隆形成实验、细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)、划痕实验、Transwell实验比较A549细胞株NRF2敲除与不敲除的功能表达。结果:显示A549肺癌细胞中NRF2基因稳定敲除株构建成功;NRF2敲除株下游靶基因m RNA表达及蛋白水平明显减少,且能明显降低A549肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力。结论:利用CRISPR/Cas9慢病毒系统获得了高效永久NRF2基因敲除的肺癌细胞系,该基因敲除后A549肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力都显著降低。

摘要：【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除奶山羊胎儿成纤维细胞(GFFs)中硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)基因,旨在为奶山羊敲入外源性基因奠定理论基础以及构建动物模型提供生物材料.【方法】根据“20N+NGG”原则在SCD1第4外显子和第6外显子分别设计6个靶向SCD1基因sgRNA(F1、F2、F3、S1、S2、S3),构建PX330-eGFP-sgRNA敲除载体,通过脂质体转染到GFFs中,PCR扩增阳性细胞SCD1外显子4和外显子6的核苷酸序列,连接到pEASY-Blunt载体上,测序评估不同sgRNA的敲除效率;分别在第4外显子和第6外显子选择敲除效率高的sgRNA共同转染GFFs,经流式分选获得敲除SCD1基因的GFFs.【结果】设计的6个sgRNA均能够连入PX330-eGFP载体中,单克隆菌测序试验表明sgRNA F2、sgRNA F3、sgRNA S1和sgRNA S2具有敲除作用,其敲除效率分别为41.67%、30.77%、6.67%和28.57%;实时荧光定量PCR检测结果表明sgRNA-F2-S2与sgRNA-F3-S2转染组均能显著降低阳性细胞中SCD1的mRNA水平(P<0.05);Western Blot检测结果表明在阳性细胞中均未表达SCD1蛋白.【结论】获得两株敲除SCD1基因的GFFs,为制备敲除SCD1基因奶山羊核供体提供了生物材料.

摘要：利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,建立DDX5基因敲除的PK-15细胞系。使用E-CRISPR在线设计网站分别对猪DDX5第1外显子和第2外显子设计sgRNA,以质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro(pX459)为载体,将退火后的sgRNA连接到线性化载体pX459上,得到敲除载体pX459-sgRNA-DDX5。以脂质体Lipofectamine2000转染pX459-sgRNA-DDX5至PK-15细胞,经嘌呤霉素压力筛选得到单克隆细胞,通过扩增基因组DDX5序列进行测序和Western-blot鉴定筛选细胞系中DDX5敲除效果。DNA测序结果表明:sgRNA被成功插入载体pX459,并在靶向基因编辑位点产生移码突变;经Western-blot验证,敲除细胞系中DDX5蛋白基本不表达。上述结果表明,本研究采用CRISPR/Cas9技术成功构建了敲除DDX5基因的PK-15细胞系。

摘要：MMP-2 与蹄叶炎的发生密切相关。本试验通过 http://***/网站设计MMP-2的sgRNA,将sgRNA的合成物连接到经Esp3I限制性内切酶切割的lenticrispr v2载体上,构建完整敲除载体;并将该载体转染到小鼠成纤维细胞中,通过 Western Blot 检测 MMP-2 蛋白表达量。经菌液 PCR鉴定和PCR产物测序表明载体构建成功;Western Blot结果显示,基因敲除组的MMP-2蛋白表达量明显降低,表明成功敲除小鼠成纤维细胞中 MMP-2 基因。为进一步在细胞层次研究 MMP-2 基因对蹄叶炎作用及机理提供了条件。