摘要：从JGI数据库玉米弯孢叶斑病菌(Curvularia lunata)基因组中获得2个编码NADPH氧化酶基因ClNox1和ClNox2。采用生物信息学方法对2个基因编码的蛋白质进行性质、结构和功能等方面的预测。结果表明,ClNox1和ClNox2的分子量分别为6.35和6.41 KD,等电点PI为8.87和8.93,不稳定指数为44.50和39.45;ClNox1是亲水性膜蛋白,包含6个明显的跨膜结构域;ClNox2也是膜蛋白,包含8个明显的跨膜结构域。在亚细胞水平上,ClNox1定位于线粒体上,而ClNox2定位于细胞质膜上;在氨基酸序列方面,ClNox1和ClNox2都含有多个苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸激酶磷酸化位点;在功能方面,ClNox1和ClNox2都包含NADPH氧化酶特征结构域,并且与Cochliobolus heterostrophus的NADPH氧化酶基因具有较高的同源性。根据ClNox1和ClNox2序列设计特异性引物扩增目的片段,与标记基因NPTII和HphGFP分别连入骨架载体pPZP100,构建完成ClNox1和ClNox2基因的敲除载体pPZP100NPTIIClNox1和pPZP100HphGFPClNox2,为根癌农杆菌介导的遗传转化提供基础材料。

摘要：在哺乳动物中,bmp4可以通过BMP信号通路调节原始生殖细胞(Primordial germ cells, PGCs)的形成,但其在鸡PGCs形成过程中的功能和机制仍不清晰。构建鸡bmp4的过表达及敲除载体,并转染DF-1细胞检测活性。通过同源重组技术构建pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP重组载体,转染DF-1细胞,RT-qPCR检测bmp4的表达;根据bmp4 CDS序列设计3个敲除靶位点(gRNA),插入PGMLV-GM1构建gRNA序列的重组载体bmp4-sgRNA1、bmp4-sgRNA2和bmp4-sgRNA3。Cas9载体与bmp4-sgRNA载体共转染DF-1细胞,T7E1酶切和TA克隆试验检测敲除载体活性及敲除效率。扩增获得bmp4 CDS全长1546 bp,并成功构建pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP载体,将其转染DF-1细胞后有绿色荧光表达(25.17%±0.007),RT-qPCR检测结果表明,与对照组相比转染pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP的细胞中bmp4显著上调(P<0.01)。3个gRNA重组载体构建成功,转染DF-1细胞后T7E1酶切检测均有敲除活性,TA克隆结果显示敲除效率分别为6.25%、12.5%和18.75%。结果说明鸡bmp4过表达及敲除载体构建成功,可为后期bmp4功能验证及机制解析等研究提供技术支持。

摘要：试验旨在利用CRISPR/Cas9技术分别在鸡成纤维细胞DF-1和鸡胚胎干细胞(Em-bryomic stem cell,ESCs)上介导CPED1基因敲除,以期为后续研究CPED1基因功能提供技术依据。克隆CPED1基因全长;构建cas9/g RNA载体并转染DF-1和ESCs,经流式分选阳性细胞,采用T7E1酶切法选择活性最佳的敲除载体并分析其敲除效率;同时,对DF-1中的脱靶效率进行检测。结果成功克隆鸡CPED1基因,并构建3个cas9/g RNA载体;T7E1酶切结果表明cas9/g RNA1载体在DF-1阳性细胞中的敲除活性(37%)最佳,该载体也可定点敲除ESCs中的CPED1基因,敲除活性为25%,且在DF-1细胞中未发生脱靶。表明CRISPR/Cas9可有效介导鸡CPED1基因在DF-1和ESCs上敲除。

摘要：CCKAR在许多疾病的发病机理中具有重要作用。为研究其分子机制,选择利用CRISPR/Cas9基因编辑体系,构建KO载体。根据CCKAR基因序列设计敲除靶点,通过质粒单酶切、Oligo退火、连接,成功构建了CCKAR的敲除载体。该质粒的成功构建可为将来CCKAR基因的功能研究提供重要的基础。

摘要：[目的]通过对玉蜀黍尾孢菌VelB基因进行生物信息学分析并构建敲除载体,为研究CzVelB调控玉蜀黍尾孢菌致病性的分子机制奠定基础。[方法]从JGI数据库中获得CzVelB基因序列,对其进行生物信息学分析,包括蛋白质的性质、保守区域、磷酸化位点、亚细胞定位、跨膜结构域和聚类分析,分析其基因功能。并采用同源互补原理构建CzVelB基因敲除载体,最终采用农杆菌介导遗传转化技术进行基因敲除。[结果]CzVelB基因编码385 AA,预测pI和MW分别为9.05和42.13645 kDa,是亲水性蛋白,无跨膜结构域。在亚细胞水平上,CzVelB定位在细胞核中。在氨基酸序列方面,具有多个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸激酶磷酸化位点;在功能上具有2个Velevt的保守结构域,并与Aspergillus flavus、***亲缘关系较近,具有较高同源性。根据CzVelB基因序列设计特异性引物,扩增侧翼片段和标记基因,分别连入骨架载体pPZP100中,成功构建CzVelB基因的敲除载体,最终利用ATMT技术获得其敲除转化子。[结论]本文系统研究玉蜀黍尾孢菌VelB基因功能,并成功构建其敲除载体,获得敲除转化子,为后续研究CzVelB基因功能提供基础材料。

摘要：Toll样受体(toll-like receptor,TLR)成员TLR4可识别革兰氏阴性细菌的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),参与宿主免疫炎症反应。研究旨在通过干扰基因TLR4,以阐释TLR4对炎性细胞因子基因表达水平和鸡巨噬细胞HD11凋亡的影响,为完善TLR4在鸡免疫反应中的分子调控机制提供一定依据。不同剂量LPS感染鸡HD11细胞,检测感染后不同时间点TLR4及免疫炎性相关基因表达量。设计3条TLR4基因干扰片段,分别转染鸡HD11细胞,qRT-PCR和流式分别检测LPS感染前后TLR4和免疫炎性相关基因表达量以及细胞凋亡。结果显示,1μg/mL LPS感染8 h时诱导基因TLR4、IL-1β、IL-8和IL-6的表达效果最佳。成功干扰TLR4基因后,LPS感染鸡HD11细胞时促炎因子基因IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α表达量显著性降低(P0.05)。结果说明,调节TLR4基因的表达可直接影响细胞对LPS的炎症反应,为控制过度炎症反应提供新思路和干预靶点,对缓解应激性病理损伤和提高家禽健康具有实践意义。