摘要：试验根据GenBank中登录的鸡毒支原体16S rRNA基因序列,用DNAStar和Primer 5.0软件自行设计探针,并进行地高辛标记。采用带正电的尼龙膜对提取的鸡毒支原体DNA进行斑点杂交反应,建立最佳的反应条件,并采用建立的条件对市场上随机购买的鸡新城疫活疫苗进行检测。结果显示,运用斑点杂交反应可以从疫苗样品中检测到支原体的污染,检出率为23.3%(7/30)。表明该方法快速、特异性、敏感性高,对生物制品中支原体污染的快速检测具有较高的应用价值。

摘要：目的体外斑点杂交实验模拟体内环境验证计算机辅助软件设计的反义寡核苷酸序列的活性。方法采用计算机辅助软件对多重耐药鲍曼不动杆菌生长必须基因gyrA的mRNA进行二级结构分析计算,设计出10条反义寡核苷酸序列,合成探针与体外转录并用地高辛标记的gyrA mRNA进行斑点杂交,分别选择一条杂交信号最强和一条杂交信号弱的探针序列合成连接穿膜肽序列的肽-肽核酸,以不同浓度的肽-肽核酸处理鲍曼不动杆菌标准株ATCC19606和多重耐药株,测定经不同浓度PPNA处理的细菌光密度A600值并进行平板菌落计数,观察其对细菌生长的抑制作用。以20μmol/L杂交信号强的肽-肽核酸作用于铜绿假单胞菌,测细菌光密度A600值,观察其对细菌生长的抑制作用。结果杂交信号强的肽-肽核酸对多重耐药的鲍曼不动杆菌和ATCC19606均有明显的体外抗菌活性,其最低抑菌浓度分别为5与10μmol/L,10μmol/L浓度时对两种细菌均具有杀菌活性,而杂交信号弱的肽-肽核酸对细菌的生长无抑制作用,即使将其浓度增加到20μmol/L。杂交信号强的肽-肽核酸对铜绿假单胞菌无生长抑制作用。结论体外斑点杂交实验能够验证计算机软件预测设计的具有特异性的反义核酸的活性,为体外可靠、快速、高通量筛选高效反义序列提供了一种有效的方法,并且为筛选所有基因高效反义序列搭建了一个平台。

摘要：目的:建立一种利用DNA探针快速检测烟曲霉菌的斑点杂交方法。方法:在烟曲霉特异的碱性蛋白酶基因序列内设计引物,聚合酶链反应合成一段465bp的DNA探针,用地高辛标记探针并与烟曲霉、黄曲霉、念珠菌、隐球菌等真菌以及细菌DNA行斑点杂交,并将该方法应用于临床标本的检测。结果:所合成的探针具有高度特异性,与其他真菌、细菌间无交叉反应,该方法的敏感性达100fg。100份临床标本曲霉培养阳性者6份,杂交阳性者13份。结论:斑点杂交法具有快速、敏感、特异的优点,对烟曲霉菌感染的快速诊断有重要意义。

摘要：本研究目的是通过斑点杂交方法对不同种类的海参进行快速准确的鉴定。采用CTAB沉淀法提取海参的DNA,PCR扩增线粒体COⅠ基因并测序,利用Primer premier 5.0软件设计并筛选了仿刺参(Apostichopus japonicus)、北大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)、加州红参(Parastichopus californicus)及梅花参(Thelenota ananas)4种海参的特异性探针,设计并进行斑点杂交实验。实验结果显示:4条探针均具有高度的特异性,灵敏度可达100pg,能够实现对仿刺参、北大西洋瓜参、加州红参和梅花参的准确鉴定。本文建立的斑点杂交方法,为海参品种的快速、准确的鉴定提供了可靠的技术方法。

摘要：目的确认贝氏柯克斯体特异的核酸标识。方法用PCR法特异扩增贝氏柯克斯体24kDa,27kDa、30kDa、34kDa、热休克蛋白B等表面蛋白基因,以及23SrRNA插入序列和16S23SrRNA间区序列等基因片段,从DNA电泳凝胶中回收纯化PCR扩增的目的DNA片段,用地高辛随机引物标记法标记目的DNA片段作探针,行DNA斑点杂交。结果PCR扩得的7个贝氏柯克斯体DNA片段探针只能与贝氏柯克斯体基因组DNA杂交而不能与其他种属的立克次体的基因组杂交,每种探针检测同源目的基因的灵敏度可达到10pg。结论这7种贝氏柯克斯体DNA片段是贝氏柯克斯体特异的DNA片段,可作为贝氏柯克斯体的核酸标识,基于它们的序列设计的引物和探针具有极高的贝氏柯克斯体种特异性。

摘要：目的探讨斑点杂交技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因mec A的应用价值。方法设计mec A基因特异性引物,用地高辛标记;制备mec A基因探针,运用斑点杂交方法、聚合酶链反应(PCR)法检测mec A基因。结果 100例临床分离的金黄色葡萄球菌中共检出mec A基因阳性32例,阳性率为32%;PCR方法检出阳性36例,阳性率为36%。结论通过斑点杂交技术可以方便、特异地检测出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mec A基因。

摘要：为了筛选出能与铜绿假单胞菌PAO1 motA基因的mRNA结合紧密的反义寡核苷酸序列,采用全基因寻靶技术(full length gene targeting,FLGT),运用计算机软件(Mfold和RNA Structure4.6)模拟铜绿假单胞菌PAO1 motA基因mRNA的二级结构,根据最小自由能原理设计出8条寡核苷酸探针序列;PCR扩增出全长motA基因,克隆motA基因并进行体外转录,同时用地高辛标记mRNA,以斑点杂交方法筛选出与motA基因mRNA结合紧密、杂交信号较强的寡核苷酸序列。斑点杂交结果显示8条寡核苷酸中的4条有较强的杂交信号,从而成功筛选到了能与motA mRNA牢固结合的反义序列,为进一步研究以motA基因为靶的反义技术抑制生物膜形成打下基础。

摘要：目的探讨DNA原位杂交法及斑点杂交法在卡氏肺孢子虫检测中的应用。方法设计合成卡氏肺孢子虫特异性寡核苷酸探针,建立卡氏肺孢子虫大鼠动物模型,分别于第6、8、10周处死动物,取肺组织提取DNA及石蜡切片进行斑点杂交及DNA原位杂交,结果同瑞氏-吉氏染色法比较。结果DNA原位杂交法和斑点杂交法第6周检出阳性结果,检出率均为(30/30),高于瑞氏-吉氏染色法(25/30)。结论 DNA原位杂交法及斑点杂交法是高效准确的卡氏肺孢子虫检测方法。

摘要：目的建立一种更加简便的A组人轮状病毒(HRV)核酸斑点杂交VP7分型方法,以便用于对HRV流行情况进行调查。方法在HRVVP7编码基因各G基因型间高度变异而型内高度保守区域设计分型探针,在该区域的两侧相对保守区域设计一对通用引物,利用PCR分别将地高辛标记HRV5种常见型别(G1～4,G9型)的DNA探针,建立基于VP7的斑点杂交方法;选取经抗原检测和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测均为HRV阳性的2006至2008年住院腹泻患儿粪便标本200份,RT-PCR扩增VP7全基因,并对扩增阳性产物应用斑点杂交方法进行G型别分析。结果建立的斑点杂交方法在5种型别探针间无交叉反应,各型探针的检测灵敏度可达到10pg。200份PAGE阳性标本中162份RT-RCR扩增VP7基因阳性,斑点杂交显示G1型41例(25.3%),G2型2例(1.2%),G3型63例(38.9%),G9型35例(21.6%),混合感染19例(11.7%),杂交未分出型2例(1.2%),未检测到G4型HRV。结论本研究所建立的斑点杂交方法敏感度和特异度强,适合在HRV大规模分子流行病学调查时应用。通过该方法的初步应用,发现北京地区婴幼儿HRV除了常见的G1、G2和G3型外,还有G9型感染。

摘要：为建立猪肺炎支原体斑点杂交检测方法,并用于猪肺样品的检测,根据GenBank中登录的猪肺炎支原体(Mhp)P36基因序列,设计并合成一条地高辛标记的DNA寡核苷酸探针。进行Mhp斑点杂交反应,建立最佳反应体系和反应条件,对该方法进行特异性和敏感性试验,并采用最佳反应体系和反应条件在尼龙膜上对猪肺组织样品进行检测。结果表明,该检测方法可有效从可疑病料的猪肺组织中检出Mhp感染,检出率为39.5%。本研究建立的Mhp斑点杂交检测方法快速、敏感、特异,对Mhp的临床检测具有较好的应用价值。