摘要：【目的】探究酪氨酸酶相关蛋白1b(tyrosinase-related protein 1b,TYRP1b)基因变异与斑马鱼体色性状的相关性。【方法】以体色表型存在显著差异的红色、黄色和蓝色斑马鱼共计219个样本的肌肉组织DNA为模板,设计3对引物,采用PCR扩增、Sanger测序技术筛查TYRP1b基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs),并将SNPs与斑马鱼体色性状进行关联分析。【结果】获得的斑马鱼TYRP1b基因外显子2、部分内含子3、外显子4、内含子4、外显子5、内含子5、外显子6和外显子7长度分别为134、212、168、135、180、113、150、171 bp。SNPs筛查显示,3种体色斑马鱼群体共筛查到18个SNPs,部分内含子3存在11个SNPs位点:g.2125G>A、g.2150G>A、g.2152G>T、g.2161C>A、g.2175A>T、g.2180G>T、g.2185A>T、g.2192A>C、g.2200A>T、g.2201A>C和g.2213T>C;内含子4检测到4个SNPs位点:g.7C>A、g.65A>G、g.84T>A和g.103C>T;内含子5存在1个SNPs位点:g.61G>T;外显子4、6分别存在1个SNPs位点:g.125G>T和g.80T>A,且均为同义突变;外显子2、5和7均未检测到SNPs。关联分析表明,TYRP1b基因内含子3中g.2152G>T、g.2175A>T、g.2180T>G、g.2192A>C、g.2200A>T、g.2201A>C位点、内含子4中g.65A>G位点及外显子6中g.80T>A位点的基因型均与斑马鱼体色性状极显著相关(P<0.01)。【结论】斑马鱼TYRP1b基因内含子3、4及外显子6存在8个与体色表型存在关联的SNPs,可能影响斑马鱼体色性状或与之紧密连锁。

摘要：为评价第二代抗凝血类灭鼠剂溴敌隆的潜在生态毒性效应,以模式动物斑马鱼为研究对象,研究了溴敌隆对斑马鱼胚胎/仔鱼的发育毒性以及对抗氧化系统的影响。研究结果表明,当溴敌隆浓度高于0.39 mg·L^(-1)时,斑马鱼胚胎/仔鱼死亡率及畸形率显著升高,与对照组相比具有显著性差异,斑马鱼仔鱼体内的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性以及还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量随溴敌隆浓度增大,均呈逐渐升高趋势,并在1.18 mg·L^(-1)浓度组达到最大值,具有显著差异,表明溴敌隆对斑马鱼仔鱼的抗氧化系统造成严重损伤,从而导致机体死亡。对溴敌隆暴露导致的斑马鱼胚胎/仔鱼的发育毒性以及氧化损伤的机制进行了初步探讨,为进一步研究溴敌隆对动物的发育毒性机制以及其潜在的生态危害提供了研究基础。

摘要：萘普生的广泛使用导致其在环境中持续输入与积累,对生态环境造成潜在的危害。金属离子Cu^(2+)虽然在自然界中普遍存在,但是萘普生和Cu^(2+)的联合毒性效应目前尚不清楚。开展了毒性预实验,根据Cu^(2+)和萘普生96 h LC 50值(毒性单位比4∶1,2∶1,1∶1,1∶2,1∶4)对斑马鱼胚胎进行混合暴露,采用相加指数(AI)法评价联合毒性影响。实验结果表明:萘普生和Cu^(2+)单独暴露对斑马鱼胚胎产生发育毒性,萘普生和Cu^(2+)所有毒性比例的联合暴露实验都对斑马鱼胚胎致死效应表现为拮抗作用。红外光谱结果对比表明:萘普生和Cu^(2+)之间能发生配合反应,所产生的配合物使二元体系联合毒性降低。

摘要：TECTB基因编码的β-盖膜蛋白(β-tectorin)在人类听觉功能中具有重要的调控作用,是内耳器官中覆盖膜的重要组成成分,在声音转导为神经信号的过程中发挥着关键作用。β-tectorin突变会导致人类非综合征性耳聋的发生,而目前关于听觉障碍发生的分子机制仍然有待研究。斑马鱼(Danio rerio)是一种常用的试验动物模型,能够对内耳发育和相关疾病的研究提供重要的价值。为了研究tectb基因在斑马鱼内耳发育中的作用,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,成功构建tectb内耳基因缺失型斑马鱼模型,并对tectb基因缺失的斑马鱼表型进行初步分析。首先,在tectb基因的第三号外显子上设计靶位点以及基因型检测引物,经体外扩增得到向导DNA(sgDNA),再对其进行体外转录,得到向导RNA(sgRNA);然后,将sgRNA与Cas9酶通过显微注射的方式注射到野生型斑马鱼胚胎中,经基因型鉴定筛选出携带突变的嵌合体F0代鱼,培养至性成熟后与野生型斑马鱼杂交得到F1代突变体杂合子;在遗传稳定性鉴定及基因序列测序之后,保留突变类型为移码突变的F1代鱼,培养至成年后,经过自交得到F2代tectb突变体纯合子;最后,通过体式显微镜初步观察及毛细胞染色试验,发现突变体斑马鱼内耳组织结构正常,耳石形态和大小没有明显差异,毛细胞的发育也没有明显缺陷,但是体内器官与组织的发育是否发生变化,需要进行深入研究。这项研究为深入了解内耳发育的分子机制和耳聋等人类疾病提供了有价值的研究模型,借助tectb基因敲除斑马鱼模型,我们可以探究该基因在疾病发生中的具体作用,更好地研究内耳发育中的关键途径,有利于进一步深入研究听力的调控机制。

摘要：设计探索转基因彩色荧光斑马鱼(Daniorerio)色素细胞的创造性实验和实践活动,观察野生型斑马鱼和转基因彩色荧光斑马鱼的色素细胞种类和形态特征,探究鳞片的色素细胞与其鱼体体色之间的联系。本活动旨在提高学生生物学实验的创新创造技能,培养科学探究精神和科学严谨的学习态度,形成理性看待转基因技术的科学态度,从而有效培养学生的科学素养、学科核心素养。

摘要：目的 采用成簇的规律性间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统对斑马鱼胱硫醚-β-合成酶b基因(cbsb)进行编辑,并制备稳定的斑马鱼cbsb敲除品系。方法 使用ClustalX软件分析斑马鱼cbsb编码蛋白(Cbsb)的保守结构域,利用生物信息学选取向导RNA(gRNA)靶点,体外合成并纯化gRNA和密码子优化的Cas9 mRNA,在刚受精的斑马鱼胚胎(1-cell期)中显微注射混合的gRNA和Cas9 mRNA,提取受精后3 d的斑马鱼幼鱼基因组,通过PCR扩增并测序分析靶点的切割效率,通过基因组扩增和测序筛选并获得cbsb敲除的稳定品系。结果 斑马鱼Cbsb与人、小鼠胱硫醚-β-合成酶(CBS)高度同源。在斑马鱼Cbsb保守结构域的编码序列处设计4个靶点,其中4#靶点具有高效的切割效率,利用该靶点制备并筛选获得多个cbsb敲除斑马鱼,选取-3+13 bps和-228 bps移码突变的两种品系,进一步筛选获得稳定的cbsb敲除品系。结论 利用CRISPR/Cas9系统成功制备了两种斑马鱼cbsb敲除的稳定品系,为进一步在斑马鱼活体中研究Cbsb的功能奠定了基础。

摘要：目的对斑马鱼Hepcidin-2基因结构进行生物信息学分析,并设计优化其抗菌活性。方法选取斑马鱼Hepcidin-2作为目的基因,通过Tblastn进行多序列同源性比对得到Hepcidin基因家族的核苷酸和氨基酸序列,利用生物信息学方法分析其进化关系、理化性质、信号肽、跨膜结构、二级结构、三级结构等;收集和筛选多个物种的Hepcidin序列152条,计算成熟肽各个位置最大频率的氨基酸,得到序列模板,并对序列模板进行预测。结果抗菌肽(antimicrobial peptide,AMP)活性中心空间结构高度保守,C-末端及信号肽区域形成跨膜螺旋结构,成熟肽部分存在β-折叠,得到的序列模板预测具有抗真菌活性,对肺炎克雷伯菌有抗菌活性,对人红细胞有溶血活性。结论建立了序列模板法优化AMP序列和预测其抗菌活性的技术路线,为改造天然AMP,扩大其在临床和生产中的应用提供了理论支持和技术支撑。

摘要：目的探究石斛相关保健食品的配方规律,并基于模式生物斑马鱼对含石斛的具有增强免疫力和缓解体力疲劳双功能保健食品的配方进行活性评价。方法对现有含石斛的保健食品批文中的信息资料进行统计分析,利用社团分析方法,探究石斛相关保健食品中保健功能与中药之间的联系规律;采用关联和复杂网络机器学习算法分析石斛相关保健食品配方中中药与中药之间的关联规则,以期深度挖掘其中的“保健功能-中药-中药”关联性。基于此,设计以石斛为核心原料的具有增强免疫力和缓解体力疲劳双功能保健食品的候选配方;建立2,2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(AAPH)和甲硝唑诱导的氧化应激斑马鱼模型及机械损伤炎症和神经炎症斑马鱼模型,对其中1种候选配方进行抗炎和抗氧化活性评价。结果共收集到含石斛的保健食品批文133件,保健功能以增强免疫力和缓解体力疲劳为主。经筛选共得到含石斛且具增强免疫力和缓解体力疲劳双功能的保健食品配方64个,所有保健功能和中药共分为7个社团,归纳为7种治疗原则,得出相应7种中医证型。统计分析发现保健食品配方中高频中药之间具有较强的关联性,并得到了核心中药组合与核心配方,确定10种中药配伍,设计了6个配方。斑马鱼活性实验结果表明其中1种候选配方(石斛、枸杞子和黄芪)对斑马鱼氧化应激损伤和炎症反应均有一定改善作用。结论机器学习算法指导中药配方合理,为中药类保健食品的配方研发和活性评价提供新的思路和方向。

摘要：目的以橄榄油和芝麻油分别作为油相进行自乳化递送系统(self-emulsifying drug delivery system,SEDDS)载体构建,考察2种SEDDS载体的药剂学性能及对斑马鱼体内炎症损伤部位递送差异。初步阐明辅料的“引药”效应,拟为炎症损伤部位有效递送材料的选择和辅料“引药达所”提供实验参考。方法结合相转变法和伪三元相图法筛选乳化剂、助乳化剂、乳化剂与助乳化剂质量比(K_(m)),星点设计-效应面法(central composite design-response surface methodology,CCDRSM)优化2种SEDDS载体处方;通过布鲁克海文纳米粒径仪测定2种SEDDS载体的中位径(D_(50))和ζ电位;利用立体荧光显微镜观察2种SEDDS载体在斑马鱼体内炎症损伤部位的递送差异。结果2种SEDDS最佳乳化剂和助乳化剂均为聚山梨酯80-无水乙醇(2∶1),最佳处方油相与K_(m)值均为1∶1,滴加适量纯水后呈半透明略带蓝色乳光液体;橄榄油和芝麻油SEDDS最佳处方D_(50)分别为(219.36±14.86)、(225.06±13.66)nm,ζ电位分别为(-3.13±0.55)、(3.58±0.10)m V。与正常组比较,2种SEDDS在炎症损伤斑马鱼体内的总荧光强度具有极显著性差异(P<0.001),相比于橄榄油SEDDS,芝麻油SEDDS在炎症损伤部位富集效果更为突出,二者主要分布在心脏和肝脏部位。结论2种SEDDS载体制备方法简单,外观良好。阐明油相因素带来的递送差异,可以为不同炎症损伤部位的有效递送材料选择、为辅料发挥“引药”作用提供实验参考。

摘要：亲本效应(parental effect)指亲代的表现型及其所经历的环境因素而非基因型对子代表现型差异和适应性的影响,对子代适合度的维持与提高具有重要生态学意义。为探究亲本效应对鱼类胚胎发育可塑性的影响,本研究选取卵生鱼类斑马鱼(Danio rerio)为实验对象,采用2×2双因素设计,测定了不同亲本繁殖温度(22、28℃)和不同胚胎孵化温度(22、28℃)及其交互作用对斑马鱼孵化表现(孵化率、胚胎死亡率、初孵仔鱼畸形率、孵化历时、初始孵化时间、结束孵化时间)的影响。结果表明:亲本繁殖和胚胎孵化温度交互作用对斑马鱼胚胎死亡率、初始孵化时间、结束孵化时间、孵化历时等均有显著影响(P<0.05),亲本繁殖与胚胎孵化温度相一致时胚胎的死亡率更低、孵化时间更短;斑马鱼孵化表现受亲本效应(代际发育可塑性)和子代发育环境(代内发育可塑性)的双重影响,亲本效应对早期生活史阶段鱼类表型特征的塑造有重要作用。