摘要：为了研究cx43基因抑制对斑马鱼胚胎心血管系统发育的影响,针对cx43的翻译起始位点设计两个吗啉修饰的反义寡核苷酸抑制其表达,在斑马鱼受精卵一到两细胞期混合注射并且验证其有效性.注射后用原位杂交和原位免疫荧光检测心脏标志基因的表达以及心脏的表型,同时利用显微荧光造影和原位杂交检测血管的发育情况.用心室心房的标志基因vmhc和amhc反义RNA探针进行的原位杂交结果显示,vmhc表达抑制,而amhc表达上调.原位免疫荧光显示与原位杂交一致的结果表明:心房扩张心室缩小,并且心脏环化不全.用血管标志基因flk-1的RNA探针原位杂交和显微荧光造影表明,cx43基因抑制的斑马鱼胚胎血管无明显缺陷.此外,cx43基因抑制的斑马鱼胚胎心脏功能也有明显改变,包括心脏搏动无力,有血液回流现象.抑制cx43的表达可能通过影响两个细胞群的迁移导致斑马鱼胚胎心脏的发育缺陷,从而影响了心脏的功能,但是未发现胚胎血管系统发育的明显缺陷.

摘要：WBP11是WW结构域结合蛋白家族的一员,参与前体mRNA剪接过程,是重要的剪接因子。斑马鱼作为重要的模式生物之一,其基因组中含有人类WBP11的同源基因wbp11。为了研究WBP11在脊椎动物早期发育过程中的作用机制,利用CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼wbp11基因敲除品系。首先,在wbp11基因的第二个外显子上设计基因敲除靶位点,体外转录合成sgRNA,通过显微注射技术对斑马鱼进行基因敲除,得到F0代嵌合体斑马鱼。随后,将嵌合体斑马鱼与野生型斑马鱼杂交,所得到的F1代斑马鱼进行基因型鉴定,筛选出其中的杂合子斑马鱼,并对杂合子斑马鱼的缺失条带进行测序,结果显示其为wbp11基因的2种缺失突变。让同种突变的F1代杂合子斑马鱼自交,对得到的后代F2进行基因型鉴定,筛选获得了纯合子斑马鱼,表明wbp11基因敲除品系构建成功。经显微镜白光成像观察发现,受精后48 h的斑马鱼出现心包水肿、心脏线性化、骨骼弯曲畸形,这可能是由于wbp11基因突变引起剪接机制异常所导致的。此研究为探究WBP11基因在脊椎动物的早期发育中的作用机制开辟了道路。

摘要：运用RNA干扰技术,针对斑马鱼血管内皮生长因子(VEGF)基因设计并合成了特异性小分子干扰RNA(siRNA),并从血管形成水平研究了siRNA对VEGF基因表达的影响。为了得到能在体内稳定表达的siRNA,进一步以pSilencer4.1-CMVVector为载体,合成了短发夹RNA(shRNA)表达模板并定向克隆到CMV启动子下游,构建了shRNA表达载体。定量碱性磷酸酶染色显示注射合成的siRNA后胚胎新血管生成(angiogenesis)为71.8%,NBT/BCIP血管染色显示表达载体可以引起斑马鱼胚胎肠下静脉、节间血管发育缺陷,原位杂交结果显示胚胎头部及前原肾管部位VEGF表达异常。

摘要：原钙黏附蛋白18b(Protocadherin18b,Pcdh18b)属于钙黏附蛋白家族成员.为了研究pcdh18b基因抑制对斑马鱼神经系统发育的影响,针对pcdh18b的翻译起始位点设计一个吗啡啉修饰的反义寡核苷酸抑制其表达,在斑马鱼受精卵一到二细胞期注射并且验证其有效性.注射后用原位杂交和吖啶橙染色检测神经系统的表型和标志基因的表达.pcdh18b下调使神经前体细胞的标志基因neurog1、神经元标志基因elavl3和神经胶质细胞标志基因gfap的表达均出现下调,中后脑边界的标志基因pax2a和wnt1表达减弱并出现神经管分叉现象,同时与后脑分节相关的基因krox20表达减少.吖啶橙染色显示pcdh18b下调后斑马鱼中脑、后脑及中后脑边界细胞凋亡增多.这些结果表明pcdh18b抑制导致了斑马鱼神经系统发育的异常。

摘要：为进一步了解硬骨鱼类特有的finTRIM(Fish novel tripartite motif,ftr)在斑马鱼(Danio rerio)抗病毒天然免疫中的作用,研究克隆了斑马鱼ftr56基因并分析了其对鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)增殖的抑制作用。根据NCBI中斑马鱼ftr56序列设计引物,采用PCR方法,扩增ftr56 CDS区,连接至真核表达载体pcDNA4.0-His,构建真核表达质粒pcDNA4.0-ftr56-His,进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测SVCV感染斑马鱼胚胎成纤维细胞(ZF4)后ftr56 mRNA的变化。系统进化树分析显示,斑马鱼FTR56单独聚为一支。氨基酸多序列比对结果显示,其与黑猩猩、牛、鼠的TRIM56相似度为22%—23%。FTR56二级结构具有1个RING指结构域,1个B-box结构域,1个卷曲螺旋结构域和1个B30.0结构域。qRT-PCR检测结果显示,ftr56在SVCV感染后24h表达量显著上升。在过表达ftr56后,SVCV的G蛋白mRNA水平和蛋白水平在12h和24h相比对照组明显减少,培养基上清中SVCV滴度也明显降低,表明FTR56抑制SVCV的增殖。实验为进一步揭示finTRIM在鱼类病毒性疾病中的免疫调节机制提供参考。

摘要：目的以斑马鱼为模式生物,建立谷氨酸功能低下精神分裂行为模型,并考察阳性药的有效性。方法以NMDA受体拮抗剂——地卓西平马来酸盐[(+)MK-801]为诱导剂,利用自行设计的斑马鱼行为视频跟踪分析系统,水平与垂直两个方向观察记录斑马鱼在药物作用下的行为,以自发活动路程和穿越次数作为考察指标。结果与正常组相比,6 min内MK-801组水平方向运动路程增加(P<0.01),而垂直穿越次数降低(P<0.01),同时伴有明显的异常行为;预防给予阳性药干预后,其行为表现与MK-801组相比,氯氮平和奥氮平组鱼的水平运动活动性降低(P<0.01,P<0.05),异常行为减少(P<0.01),垂直穿越行为几乎完全消失。提示,在斑马鱼模型上,MK-801诱导产生的行为变化与致小鼠精神分裂模型得到的结果相一致,氯氮平和奥氮平能有效对抗MK-801致斑马鱼的高活动性,但对其探索行为有明显抑制的作用,可能与抑郁行为有关。结论药物处理使得斑马鱼产生特征性行为模式,可用于抗精神分裂症与其他精神神经障碍类药物活性的快速筛选模型。

摘要：孕烷X受体(Pregnane X receptor,PXR)是核受体超家族(NRs)中NR1I的重要成员之一,在保护机体免于内源性和外源性物质损伤方面具有重要作用。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立PXR基因敲除的斑马鱼模型,为研究环境污染物的毒性机理及代谢过程提供基础模型。根据PXR基因序列,设计gRNA靶位点,体外转录合成gRNA。同时,将设计合成的gRNA与Cas9 mRNA通过显微注射转入斑马鱼受精卵,经孵化、筛选出有效的突变体,并逐代培养杂交筛选出PXR基因敲除突变体。结果表明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功敲除PXR基因,经测序分析获得稳定的PXR(+4/+4)基因纯合体。

摘要：通过构建ITGB2(整合素β2亚基)瞬时敲除斑马鱼模型,探讨ITGB2在中性粒细胞的迁移与巨噬细胞的发育中发挥的作用。使用CRISPR/Cas9技术设计敲除斑马鱼的ITGB2,然后利用苏丹黑染色观察瞬时敲除组和正常斑马鱼的全身中性粒细胞的分布情况及切尾后中性粒细胞的迁移情况;进一步采用中性红染色观察瞬时敲除组和正常斑马鱼脑室巨噬细胞的早期发育情况及永久造血后脑室巨噬细胞的发育情况。结果显示:敲除斑马鱼的ITGB2后,会使全身的中性粒细胞在尾部造血循环中表达增加,急性损伤后中性粒细胞迁移到伤处的数量减少;发育3 d后脑室巨噬细胞的数量比正常斑马鱼少,永久造血后脑室巨噬细胞的数量依旧比正常斑马鱼少。由此可认为,ITGB2对于斑马鱼的中性粒细胞和脑室巨噬细胞十分重要,会影响中性粒细胞的迁移情况以及脑室巨噬细胞的发育情况。

摘要：目的:克隆斑马鱼PKR(ZPKR)及其剪接异构体(ZPKRV)并对其进行鉴定和转录表达分析。方法:采用基因克隆法克隆ZPKR及ZPKRV;利用生物信息学方法分析其结构差异,设计定量分析引物;使用病毒双链RNA类似物(Poly I:C)刺激,提取斑马鱼组织总RNA并反转录合成c DNA,通过q PCR检测ZPKR及ZPKRV转录表达的差异,推测ZPKR及ZPKRV的功能。结果:首次在斑马鱼组织中克隆到ZPKRV;生物信息分析显示,ZPKRV仅仅在ZPKR的双链RNA结合结构域和激酶区之间的链接区缺失了28个氨基酸残基,并且缺失的序列包括链接区的碱性区;Poly I:C刺激后的转录表达显示,在刺激后的12 h,ZPKR表达上调到第一个峰值,24 h又下调,48 h再上调;而ZPKRV仅在刺激后24 h表达上调到最高,然后下调。结论:ZPKRV碱性区的缺失,可能会导致其单链RNA结合功能的丧失,进而促进蛋白的翻译表达;ZPKR和ZPKRV同时表达,可能通过显性的负效应,降低PKR在抗病毒免疫反应中对蛋白翻译的抑制作用,促进抗病毒免疫细胞因子的翻译表达。

摘要：细胞周期蛋白C(cyclin C)与细胞周期依赖性蛋白激酶cdk8结合,通过磷酸化RNA聚合酶Ⅱ和TFIIH调控转录.在脊椎动物胚胎发育过程中有关细胞周期蛋白C合子型转录激活机制尚知甚少.本研究克隆了斑马鱼细胞周期蛋白C基因,并用Northern杂交和整体原位杂交技术检测其在胚胎发育过程中的表达状态.结果显示,斑马鱼细胞周期蛋白C高度保守,与人细胞周期蛋白C有88%的蛋白序列同源;斑马鱼细胞周期蛋白C在母型期开始表达,其表达伴随中囊胚转换时期的合子型转录激活以及整个胚胎发育过程.