摘要：目的　探讨CAP5 9基因最大外显子序列对新生隐球菌进行分型的可行性。方法　根据CAP5 9基因最大外显子序列设计 1对引物 ,对新生隐球菌 5个血清型菌株进行PCR扩增和测序 ,用GenBank数据库分析序列的差别 ,Phylip3.6a3软件处理数据并绘制种系进化树 ,选择一定数量的新生隐球菌临床分离株和其他致病真菌进行临床验证。结果　新生隐球菌不同血清型菌株的CAP5 9最大外显子序列存在差别 ,临床验证显示CAP5 9基因最大外显子对受试菌株分型结果与免疫学分型结果全部符合。结论　以所设计引物扩增的基因可以作为新生隐球菌分型和检测的分子生物学工具。

摘要：目的克隆新生隐球菌ISC10基因(Meiosis-specific protein required for spore formation)的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析。方法从新生隐球菌B3501菌株中分离提取总RNA,逆转录成cDNA,运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得新生隐球菌ISC10基因,构建pGM-T/ISC10重组载体,测序后与GenBank中ISC10基因(DQ332212)进行同源性比较和序列分析。结果所克隆的基因共编码267个氨基酸,分子量为31.65KD,与GenBank中ISC10基因(DQ332212)序列同源性达99.10%,编码的蛋白质在67位氨基酸由Ala(丙氨酸)突变为Pro(脯氨酸),233位氨基酸由Thr(苏氨酸)突变为Ser(丝氨酸)。结论所克隆的基因为新生隐球菌的一个新基因,其相关生物学信息的明确,为应用分子生物学技术进一步深入研究新生隐球菌的感染和致病机制奠定了基础。

摘要：新生隐球菌的多聚糖荚膜成分是新生隐球菌血清型分型的物质基础[1],而CAP64荚膜相关基因是新生隐球菌荚膜合成的必需基因之一[2],我们根据新生隐球菌血清型D CAP64荚膜基因的序列设计引物,将设计的引物扩增5个标准血清型新生隐球菌,已分型和未分型新生隐球菌临床分离株,以及其他的致病真菌,以寻找引物的型特异性。

摘要：目的建立白念珠菌和新生隐球菌系统感染裸小鼠模型。方法采用对裸小鼠腹部注射白念珠菌及隐球菌菌悬液的方法,观察记录1～2d内裸小鼠的毒性反应情况和死亡分布,并进行病理检查。根据寇氏法设计测定半数致死量(LD50),并检测感染前后脾脏自然杀伤(NK)细胞活性的变化。结果分别观察白念珠菌和新生隐球菌菌悬液对裸小鼠的急性毒性;检测到裸小鼠腹腔注射白念珠菌菌悬液的LD50为1.6×107cfu/ml,注射新生隐球菌菌悬液的LD50为2.0×107cfu/ml。白念珠菌、新生隐球菌感染裸小鼠时,脾脏组织NK细胞的活性下降。结论建立了白念珠菌和新生隐球菌系统感染裸小鼠模型,为讨论在T细胞为主的细胞免疫缺失的情况下,以B细胞NK细胞为主的体液免疫系统如何应对白念珠菌和新生隐球菌感染提供了一个极好的实验动物模型。

摘要：以新生隐球菌DNA中一段高度保守序列为目的序列,结合PCR和DNA探针技术优点,设计出特异引物和探针,并优化新生隐球菌荧光定量PCR反应体系,研究出实时荧光定量PCR检测技术检测新生隐球菌DNA的方法.结果显示：标准株及临床样本株新生隐球菌保守序列为124 bp;重组质粒pUCM-T中目的基因片段序列碱基符合率100%;当质粒标准品浓度1.0×103~1.0×107Copies/mL时,相关系数为0.997,有很好的线性关系;各浓度标准品的Ct值变异系数均小于5%,表明此技术的重复性好,用特异性引物扩增可检测出5.0×102Copies/mL的新生隐球菌DNA,说明该方法敏感性很好.

摘要：利用双重杂交筛选法从已经构建的 A 型新生隐球菌 DNA 克隆库(pCN)中筛选特异性探针。依据克隆库载体 pUC18的核苷酸序列设计并合成一对引物,PCR 扩增克隆库的插入片段,制备杂交膜。同位素标记26种鉴别菌及正常人的总 DNA 与克隆库的 PCR 产物杂交,获得28个候选克隆。同位素标记候选克隆的插入片段(以低熔点胶回收)与上述27种鉴别 DNA 杂交,获得特异性探针。结果:从已经构建的 pCN 中筛选出了3个特异性探针:pCNⅡA6、pCNⅡB5、pCNⅢG1,其中 pCNⅡA6只与A型新生隐球菌的 DNA 杂交,而不与其它鉴别 DNA 杂交,为 A 型特异性克隆;pCNⅡB5只与新生隐球菌的 DNA 杂交,为种特异性克隆;pCNⅢG1只与 A、D 型新生隐球菌的 DNA 杂交,为新生变种特异性克隆。应用上述特异性探针可以对隐球菌感染进行早期快速诊断及区分新生变种和格特变种。

摘要：目的构建靶向新生隐球菌MIS1基因的siRNA重组表达载体质粒,并进行鉴定。方法根据GenBank的MIS1基因序列,按照载体要求设计单链引物,克隆到空载体psilencer4.1-CMV neo中,经过LiAc化学法将重组质粒转染到新生隐球菌细胞中并用G418筛选,利用real time PCR鉴定阳性细胞的MIS1基因水平。结果重组表达质粒Psilencer4.1-CMV-si-MIS1经PCR、双酶切及测序鉴定,结果证明重组表达载体构建成功,其能在mRNA水平显著抑制MIS1的表达。结论已成功构建新生隐球菌MIS1基因的siRNA表达载体,为深入研究MIs1在隐球菌相关疾病的发生及发展中的作用提供了技术手段。

摘要：目的探讨快速获取高质量的新生隐球菌总RNA的实验方法。方法选取新生隐球菌的荚膜株、荚膜缺陷株,分别设计采用4种方法提取总RNA:酸洗玻璃珠法、液氮研磨法、异硫氰酸胍一步法、冷酸洗玻璃珠联合Yeast RNA kit法。用紫外线分光光度计测量其OD260、OD280的值,并且进行琼脂糖凝胶电泳,同时应用定量PCR法鉴定RNA质量。结果酸洗玻璃珠法、液氮研磨法、异硫氰酸胍一步法、冷酸洗玻璃珠联合Yeast RNA kit法的RNA产量分别为0.2μg/105细胞、0.4μg/105细胞、0.1μg/105细胞、0.6μg/105细胞。结论冷酸洗玻璃珠联合Yeast RNA kit法提取的RNA均一性和完整性最好,是简便、快捷地提取具有荚膜和细胞壁双重屏障的新生隐球菌RNA的理想方法。

摘要：目的了解及比较两组毒力差异明显的新生隐球菌格鲁比变种的多位点序列分型(MLST)的特点并进行交配型鉴定。方法采用多位点序列分型(MLST)的方法,设计7个看家基因(CAP59,GPD1,LAC1,PLB1,SOD1,URA5和IGS1)的引物,扩增并分析来源分别为环境和临床的各10株新生隐球菌格鲁比变种的基因型,并鉴定实验菌株交配型,与多位点微卫星分型(MLMT)结果对比,比较不同基因分型方法在分类中的稳定性和可靠性。结果在微卫星分型中为MLMT-36的10株环境分离株,MLST分型为ST-15,而在微卫星分型中为MLMT-13型的10株临床分离株,MLST分型为ST-32,所有菌株交配型均为MAT-α。结论 MLST分型结果与MLMT分型结果高度一致,提示以上两种分子分型技术在真菌分类鉴定研究中可显示对于其分离背景及进化来源的高分辨率及稳定性。

摘要：以课题组前期发现的咔啉类抗真菌化合物JYJ-19为先导化合物,设计合成了3个新型咔啉类荧光探针F1~F3。体外抗真菌活性结果显示,化合物F1具有中等的抗真菌活性(MIC80=32μg·mL^(-1));荧光探针F1的Stokes位移为70 nm,具有良好的光学性质,可用于荧光成像研究;亚细胞定位实验表明,F1在真菌细胞的线粒体富集;细胞内活性氧水平测试结果显示,咔啉类化合物JYJ-19作用下细胞内活性氧水平升高。上述结果表明,咔啉类化合物可能通过作用于真菌细胞的线粒体发挥抗真菌作用。