摘要：目的构建熔解曲线分析法同时检测4种临床常见革兰阳性病原菌，为临床感染性疾病的诊疗提供快速、敏感的分子生物学检测信息。方法选取临床最常见的革兰阳性病原菌：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌做为本课题研究的检测菌种。根据检测菌种的不同，分别选取不同菌种的特异性靶序列，设计种特异性引物。对种特异性引物分别用标准菌株、临床分离目标菌株、临床分离非目标菌株、非细菌性病原体以及人源基因组DNA进行常规PCR扩增以及扩增产物测序，验证引物的特异性。对目标菌种引物进行荧光PCR预实验，筛选Tm值差异较大的多对引物，进行熔解曲线分析法实验，并对熔解曲线法的反应条件与反应体系进行优化。对优化后的熔解曲线法进行特异性验证。通过检洲加入人血液中的不同细菌浓度对该方法进行敏感性分析。应用所构建的方法分别检测临床分离目标菌种各20株，分析每种菌种的熔解曲线图，熔点温度（Tm值）及其标准差（SD）的变化，评价所构建方法的稳定性。结果①对所设计的种特异性引物经常规PCR扩增产物电泳分析显示，目标菌株均有目的特异性扩增产物，非目标菌株、非细菌性病原体以及人源基因组DNA未出现特片性电泳条带。特异性扩增产物测序所得序列比对分析显示与目的菌种序列相符。②对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌的4对引物同时进行熔解曲线分析和mecA基因熔解曲线分析的条什优化结果：预变性温度94℃、120s，变性温度94℃、20s：退火温度53℃、12s：延伸温度68℃、13s；扩增循环数为40个循环，熔解曲线分析温度75℃～95℃。最佳的引物浓度为300nmol／L。③所建立的方法经特异性分析显示，上述4种目标菌种均有特异性熔解曲线，Tm值依次为81．02℃；80．32℃；82．37℃；83．10℃，峰高（cm）／峰宽（cm）均大于2．6，以此为典型的熔解曲线判断标准，则非目标菌、非细菌性病原体以及人源基因组DNA分析未见典型的熔解曲线。④方法的敏感性分析显示，上述4种目标菌和mecA基因可检测到的血液细菌浓度依次为：550、520、470、500与203CFU／mL。⑤对上述4菌和MRSA的临床分离菌各20株进行检测，结果显示，其平均Tm值依次为（80．96±0．688）℃，（80.20±0．729）℃，（82．42±0．599）℃，（83．20±0．713）℃和（80．11±0．15）℃。结论本研究所设计的针对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌和HmecA基因检测引物具有较好的菌种特异性，可用于相应病原菌熔解曲线分析法的建屯；所构建的熔解曲线法具有较好的特异性、敏感性和稳定性；并具有快速、简便、成本低廉的特点，可用于临床样本的检测；但葡萄球菌属内和肠球菌属内的Tm值较接近，必要时，可进一步用单对引物检测分析以鉴定到种。

摘要：为了建立猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)快速荧光PCR检测方法,本研究合成了该病原特异性基因P37的重组质粒,根据该基因设计荧光PCR引物和探针,并对设计的引物和探针的特异性、敏感性和重复性进行了检测。结果显示,该方法具有高度的特异性,除了识别猪鼻支原体基因组外,对猪的基因组和猪常见病原的基因组均不发生交叉反应。在敏感性和重复性试验中,该方法对猪鼻支原体的检测限为1 000copies/m L,变异系数小于3%,因此具有优良的敏感性和稳定性。用该方法检测临床样本,阳性检出率为76%(38/50),远高于普通PCR的阳性检出率(40%,20/50)。上述结果表明,本研究建立的荧光PCR方法在特异性、敏感性和稳定性方面均满足猪鼻支原体的临床检测要求,可以用于猪鼻支原体临床样品的检测。

摘要：为了建立一种特异性好、灵敏度高的非洲猪瘟病毒(ASFV)快速检测方法,试验针对ASFV B646基因保守片段设计并合成特异性crRNA(crRNA1、crRNA2、crRNA3),并根据crRNA所在的基因序列区域设计重组酶聚合酶扩增(RPA)引物(RPA1-F/RPA1-R、RPA2F/RPA2-R),通过筛选最佳RPA引物-crRNA序列组合和crRNA浓度建立ASFV的RPA-CRISPR-Cas12a快速检测方法,在评估该方法的特异性和灵敏度后对ASFV阳性临床样本进行验证。结果表明:最佳RPA引物-crRNA序列组合为RPA2-crRNA3,最佳crRNA浓度为5μmol/L;该方法仅能检测出ASFV,不能检测出猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2),特异性良好;最低检测病毒浓度为5.8 copies/μL,灵敏度较高;应用该方法对20份ASFV阳性临床样本进行检测,结果均为阳性,符合率为100%。说明成功建立了ASFV的RPA-CRISPR-Cas12a快速检测方法,该方法特异性好、灵敏度高,可用于ASFV的现场快速检测。

摘要：鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus,EeCV)是引起鳗鲡病毒性疾病的病原之一。根据GenBank已经发表的EeCV基因序列,设计一对特异性引物,对PCR反应条件优化,进行特异性、敏感性和重复性试验,建立了EeCV的PCR检测方法,并应用该方法对从福建省不同地区采集的160份疑似鳗鲡病毒性疾病病料进行了检测,其中65份表现为阳性,阳性率可达40.6%。结果表明,建立的PCR方法特异性强、敏感度高、重复性好,可以应用于EeCV引起的病害检测。

摘要：近年来,虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)流行区域不断扩大,已经成为我国南美白对虾(Litopenaeus vannamei)养殖重要病原之一。本研究根据Gen Bank中虾肝肠胞虫18S r RNA保守区域设计一套特异性引物和荧光探针,通过优化反应条件,建立检测EHP的TaqMan探针实时荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测方法。建立的方法呈良好的线性关系(R~2=0.998),灵敏度是巢式PCR的10倍。特异性试验表明:检测其他常见病原均为阴性,特异性好;重复性试验显示:批内批间变异系数均小于1.5%,重复性良好;对临床样品检测,与巢式PCR的符合率为97.81%。使用该方法对中山市、江门市和珠海市珠三角部分地区南美白对虾开展EHP流行病学调查,其中虾苗检出率为10.75%,成虾检出率为54.07%,部分区域检出率较高,要防范爆发风险。本研究建立的实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性和重复性良好,具有较好的应用前景。

摘要：为建立一种快速检测猪A群轮状病毒的检测方法,基于猪A群轮状病毒NSP4基因序列利用Premier 5.0软件设计并合成了一对特异性引物,建立了猪A群轮状病毒一步法RT-PCR检测方法,通过反复试验确定了引物的最佳退火温度为56℃,通过灵敏性试验确定了最低的检测浓度为13.17 pg/μL,通过特异性与稳定性试验表明该方法具有良好的特异性与稳定性,同时应用该方法对临床病料进行了检测,并选取扩增阳性样品进行了序列测定与分析,样品阳性率为90%(27/30),与Gen Bank中其他猪A群轮状病毒NSP4基因序列同源性均在98%以上。结果表明:该方法具有良好的灵敏性、特异性与稳定性,可以为猪A群轮状病毒病的快速检测和流行病学调查提供有效的技术手段。

摘要：为建立一种快速检测动物大肠杆菌病的方法,基于大肠埃希菌16S^23S rRNA基因序列分析,利用Premier 5.0软件设计并合成了一对特异性引物,建立了可检测16S^23S rRNA基因的PCR检测方法,通过反复试验确定了最佳PCR反应体系和反应条件,并评估了此方法的灵敏性和特异性。同时应用该方法对临床病料进行检测,检测结果与生化试验鉴定结果的符合率为100%。说明该方法具有良好的特异性和敏感性,与细菌分离培养、生化鉴定方法相比较有效降低了检测时间,提高了检测效率。

摘要：为建立一种快速检测猪瘟(CSF)疫苗中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)污染的方法,试验根据GenBank上登录的BVDV 5’端非编码区基因组序列设计1对引物,经一步法RT-PCR反应条件的优化,建立了检测猪瘟疫苗中BVDV污染的一步法RT-PCR。结果表明:该方法对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒的扩增结果均为阴性,对BVDV基因组RNA的检测灵敏度达0.1 ng,与细胞培养法的符合率达100%。应用该方法对猪瘟疫苗、牛血清等138份样品进行BVDV污染的检测,阳性污染率达11.59%。该一步法RT-PCR具有良好的特异性、敏感性、准确性和适用性,可用于猪瘟疫苗生产中血清、细胞、毒种、半成品等的质量控制及猪瘟疫苗临床应用中的质量检验。

摘要：为建立一种敏感、特异、高通量的猪细小病毒抗体检测方法,参照猪细小病毒(PPV)VP2蛋白的基因序列设计合成1对特异性引物,PCR扩增了VP2蛋白主要抗原区域,将目的片段克隆至p ET30a原核表达载体中,获得了以可溶形式表达的重组VP2蛋白,重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测显示具有良好的抗原性;以纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。结果表明:用该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清,结果均为阴性;批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与血凝抑制试验(HI)方法的符合率为94.49%;应用该方法检测869份疫苗免疫猪血清样品,免疫合格率为87.92%;检测248份未免疫疫苗猪血清样品,阳性感染率为7.25%。

摘要：试验旨在建立一种适合于蒙古绵羊肌内脂肪沉积相关基因mRNA表达量的检测方法。根据GenBank中脂肪沉积相关基因的序列,分别设计1对特异性引物,然后通过克隆测序检测引物扩增片段的正确性,最后使用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术验证方法的可行性。结果显示,最佳的PCR反应参数为:94℃预变性4 min;94℃变性30 s,58℃退火45 s,72℃延伸1 min,40个循环;72℃延伸5 min。各目的基因的熔解曲线峰值单一,目的产物稳定。结果表明成功建立了一种快速检测蒙古绵羊肌内脂肪沉积基因的Real-time PCR方法,可用于绵羊肌内脂肪沉积基因的检测及定量分析。