摘要：为建立一种快速准确检测H9亚型禽流感病毒基因的检测方法,根据GenBank中H9亚型禽流感病毒血凝素编码基因进行荧光检测引物和探针设计,建立了一种针对H9亚型禽流感病毒的荧光RT-PCR检测方法。利用该方法进行灵敏度和特异性检测,并用本方法和国家标准中的荧光RT-PCR检测方法,同时对临床样本进行检测。结果显示,仅H9亚型禽流感病毒出现了正常荧光检测曲线,而其他病毒及阴性对照均未出现;检测灵敏度为RNA终浓度10-4 ng/μL(1.30×104 copies/μL);临床样本检测结果与国标方法一致,符合率为100%。结果表明,该方法特异性强、灵敏度高,可用于H9亚型禽流感病毒检测。

摘要：研究基于弧菌属16S rRNA保守基因片段设计引物,利用恒温条件进行扩增,建立并优化了弧菌属环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,在LAMP检测方法最优条件下,验证LAMP方法的特异性、灵敏度和实际应用性。结果表明:最佳反应条件为反应温度61℃、Mg^(2+)、dNTPs和甜菜碱的浓度分别为4 mmol/L、1.8 mmol/L和0.4 mol/L;在最佳检测条件下,以4种弧菌(溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌)和8种其他菌株作为验证模板,发现该方法仅对弧菌有阳性扩增结果,证明该方法具有较高的特异性;同时,该方法对创伤弧菌DNA的最小检出量为940 fg/μL,其检测下限比常规PCR法降低了2个数量级。该研究成功建立了弧菌属细菌的快速检测方法,且方法具有良好的特异度和敏感度,为弧菌的快速检验提供了技术支撑。

摘要：随着牛结核病疫情日趋严重,快速、高效的分子生物学检测方法建立显得十分必要。试验设计合成了牛结核分枝杆菌特异性引物,优化反应条件,建立了牛分枝杆菌PCR检测方法。结果显示,所建立的牛结核分枝杆菌PCR检测方法可有效检测牛结核分枝杆菌,在模板浓度、引物浓度和退火温度分别为1.32μg/mL、0.5μm/L、54℃时最佳;性能评估显示,该方法具有较好的特异性、敏感性和临床应用性,为我省牛结核病的综合防控提供关键技术。

摘要：目的利用TaqMan实时荧光RT-PCR(real-time RT-PCR)技术建立测定人3型副流感病毒培养物滴度的方法。方法根据人3型副流感病毒HN基因的保守序列设计引物及探针,采用10倍系列稀释的体外转录HN RNA为模板,建立定量标准曲线。验证方法的专属性、敏感性、重复性,并对人3型副流感病毒的病毒培养液滴度进行检测。结果建立的方法对HN RNA标准品的检出灵敏度为4.7 copies/μL,标准曲线相关系数为0.998,扩增效率为105%。标准品的实验内重复性CV均<0.50%,实验间重复性CV<3.60%。系列稀释HNRNA标准品在低温(-80℃)下保存3年后,所测标准曲线的斜率和截距差异均无统计学意义(P=0.673)。用该方法对人3型副流感病毒分离株LZ17、LZ1501和LZ1728进行检测,结果均为阳性,3个病毒分离株滴度检测重复性CV均<10.00%;对7种呼吸道非人3型副流感病毒病原体检测均为阴性,表明该方法具有很高的专属性、敏感性和重复性。结论建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地对人3型副流感病毒滴度进行检测。

摘要：当前猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)仍是猪场常见的病原之一,给我国生猪养殖业造成了巨大的经济损失。为建立一种基于SYBR Green的PRV实时荧光定量PCR检测方法,以PRV-gE基因序列为靶标,构建pUCmT-gE重组质粒(并作为阳性质粒),针对该基因设计特异性引物,并评估该方法的灵敏性、特异性和可重复性等指标。结果表明,该方法检测下限为4.545拷贝/μL,而普通PCR检测下限为4.545×10^(2)拷贝/μL;在90.0℃出现单一的溶解峰,并与PCV2(圆环病毒2型)、PPV(细小病毒)、PRRSV(蓝耳病病毒)、PEDV(流行性腹泻病毒)和TGEV(传染性胃肠炎病毒)等不产生交叉反应。此外,该方法对15份疑似感染伪狂犬病的临床样品检出率为20%(3/15),高于常规PCR检出率(13.33%,2/15)。因此,该方法较传统PCR具有更高灵敏性,更适合用于PRV的临床早期诊断。

摘要：为了对羊衣原体病进行快速检测,试验通过模板制备、引物设计等建立了一种针对山羊衣原体的环介导等温扩增（LAMP）检测方法,同时验证了该方法的特异性,并对贵州省部分山羊场抽样采集的临床可疑病料进行了检测。结果表明：所建立的LAMP检测法特异性较好,用建立的LAMP法对当地采集的临床可疑病料进行检测,发现当地山羊群衣原体感染率为2.50%-8.00%,平均感染率为5.00%（10/200）,说明贵州省内山羊普遍存在衣原体感染的情况,所建立的衣原体LAMP法适合兽医临床快速检测。

摘要：目的构建熔解曲线分析法检测大肠埃希菌、嗜麦芽单胞菌。方法针对大肠埃希菌的16SrRNA、嗜麦芽单胞菌的促族酶B亚单位(gyrB)基因设计种特异性引物。构建熔解曲线分析法,并进行特异性验证。检测不同拷贝浓度稀释液进行敏感性分析。检测临床分离目标菌各20株,进行稳定性评价。结果特异性验证显示,目标检测菌种均有特异性的熔解曲线,融点温度(Tm)值分别为84.73、82.84℃。可检测到的拷贝浓度稀释液分别为3.56×103、1.21×104 copy/mL。稳定性评价的结果显示,Tm值(x±s)变化范围窄小,差异有统计学意义。结论所构建方法具有较好的特异性、敏感性和稳定性。并具有快速、简便、成本低廉的特点,可用于临床样本的检测。

摘要：文章对生态环境部最新发布的《环境监测分析方法标准制订技术导则》(HJ 168—2020)进行了解读,阐述了其修订目的、修订部分及主要内容。着重对分析方法标准从需求分析、文献调研、方法开发、方法比对、方法验证到形成标准的制订全过程进行了研究,并立足于当今饮用水检测领域的现状,详细探讨了该技术导则对饮用水检测领域的标准制订或分析方法建立的借鉴和指导意义,包括标准制订或分析方法建立的全过程设计、方法特性指标确认、方法比对和方法验证4个方面。

摘要：建立用于从临床样品中检测EHEC O157:H7的二重PCR方法。根据GenBank登录EHEC O157:H7序列,通过对菌体和鞭毛抗原保守性核苷酸序列的比对和分析,分别设计编码O抗原rfbE基因和编码H抗原fliC基因各1对特异性引物,建立二重PCR检测方法,并以EHEC O157:H7纯培养和模拟制备的3种阳性样品为原材料,对方法的敏感性和特异性进行分析。运用成功建立的二重PCR,从带菌率最高的牛粪便中检测EHEC O157:H7,并进行菌株分离和鉴定。成功建立了rfbE与fliC的二重PCR方法,rfbE与fliC引物比例为2.5∶1,PCR循环参数中退火温度为56℃,扩增片段长度rfbE为812 bp,fliC为625 bp。检测阳性临床样品检测敏感性可以达到10 cfu/g。检测24株非EHEC O157:H7大肠杆菌和15株非大肠杆菌,只有EHECO157:H7能够扩增出特异性的rfbE条带,EHEC O157:H7和EPEC O55:H7能够扩增出fliC。只有EHEC O157:H7能够同时扩增出rfbE与fliC 2条目的条带。从63份牛粪便样品中分离到4株EHEC O157:H7:生化试验表明4株EHEC O157:H7具有典型EHECO157:H7的生化特性;药敏试验表明4株EHEC O157:H7具有较为广谱的耐药性;rfbE序列分析与GenBank序列同源性介于97.3%～99.2%之间,fliC序列与GenBank序列同源性介于97.6%～100%之间;4株EHEC O157:H7对Balb/c小鼠的致病性有差异,EHEC O157:H728#和EHEC O157:H738#致病性强,EHEC O157:H73#和EHEC O157:H717#较弱。以rfbE和fliC为目的基因成功建立了二重PCR,敏感性和特异性良好,可用于临床样品的检测,提高细菌分离率。

摘要：目的:建立BRCA1基因全长mRNA序列测定方法。方法:根据文献和GenBank(U14680)报道的BRCA1基本序列设计6对特异性引物,建立6个特异性逆转录PCR(RT-PCR)技术,分段且扩增BRCA1全长mRNA,然后采用毛细管电泳进行cDNA测序,方法建立后用于3名健康女性样本。结果:6个特异性RT-PCR反应扩增片段相互覆盖,使序列分析结果包括全长BRCA1mRNA,共5000多bp。3名经PCR技术检测确定携带正常BRCA1基因的样本的mRNA分析结果显示,其BRCA1mRNA序列均与过往报道的正常mRNA序列完全一致。结论:所建立的RT-PCR特异性结合BRCA1基因,能用于其mRNA全长序列分析。