摘要：应用两个RNA干扰实验技术网络的RNA设计软件,模拟SD大鼠晚期糖基化终产物受体(RAGE) mRNA的二级结构,设计针对RAGE mRNA417、221和534位点的3对小干扰RNA(siRNA)序列(21nt),再转化为能表达其小发夹结构RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,分别将其克隆于pGCsi-U6/Neo/GFP载体,利用酶切和序列分析鉴定克隆的正确性。将RAGE特异性siRNA表达克隆转染肝星状细胞(HSC)-T6细胞系,以空白及转染非特异性siRNA表达克隆作为对照,分别以实时荧光定量PCR和Western印迹法检测各组HSC-T6细胞RAGE基因和蛋白质的表达。结果显示:成功构建了RAGE特异性siRNA重组表达载体pGCsi-R1、pGCsi-R2、pGCsi-R3和非特异性siRNA重组表达载体pGCsi-C,与对照组相比,转染特异性siRNA重组表达载体的HSC-T6细胞的RAGE mRNA表达受到明显抑制,在0.25～1.0nmol/L范围内,RAGE mRNA下调幅度呈浓度依赖性增加,以1.0nmol/LpGCsi-R1最显著,转染pGCsi-C的HSC-T6细胞的RAGE mRNA表达水平无明显变化。转染pGCsi-R1的HSC-T6细胞24、48和72h表达的RAGE mRNA分别较空白对照组下调(79.65±8.88)%、(78.96±7.94)%和(73.11±6.89)%(F=71.397,61.824,61.98,P均<0.01),在72h范围内,RAGE mRNA下调幅度呈时间依赖性降低。同时,转染pGCsi-R1的HSC-T6细胞50kDa和46kDa的RAGE、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA及蛋白质的表达也明显下调,分别为空白对照组的(43.91±1.18)%(F=386.19,P<0.01)、(36.33±0.78)%(F=386.07,P<0.01)、(57.53±3.25)%(F=20.91,P<0.05)和(58.48±3.08)%(F=56.59,P<0.05)。结果表明:pGCsi-R1表达的特异性siRNA可高效抑制HSC-T6细胞中RAGE基因和蛋白质的表达及肝星状细胞的激活。

摘要：目的探讨十八味诃子利尿丸对雄性糖尿病肾病(DN)大鼠肾组织RAGE-NF-κB信号通路的影响。方法自行设计研究方案开展相关研究。选取SD雄性大鼠10只作为对照组,20只(通过高糖高脂饮食联合链脲佐菌素尾静脉注射制备DN大鼠)作为模型组、藏药组,连续灌胃2周,用Western blot法及免疫组化法检测NF-κB P65、RAGE、TNF-α、IL-6、IL-1β,以光镜观察大鼠肾脏组织病理结构。对实验结果行相关统计学分析。结果与对照组比较,模型组肾组织NF-κB P65、RAGE、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达升高(P<0.05),病理损伤严重。与模型组比,藏药组肾组织NF-κB P65、RAGE、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达降低(P<0.05),病理损伤减轻。结论十八味诃子利尿丸能够通过抑制雄性DN大鼠肾组织RAGE-NF-κB信号通路活化,延缓DN的进展。