摘要：采用普鲁兰酶对甘薯淀粉进行酶解脱支处理,通过单因素试验分别考察酶解时间、酶解pH、酶解温度、酶添加量对淀粉回生值以及直链淀粉含量的影响。并根据单因素试验结果设计正交试验,结果表明:最佳酶解条件为酶解时间15h,酶解pH 4.5,酶解温度55℃,酶添加量48ASPU/g。该条件下酶解淀粉的回生值达到最高为1 925cp,直链淀粉含量达到最高为25.21%。通过与原淀粉比较得出:淀粉凝胶强度、破裂强度都显著增大(P<0.05),峰值黏度、谷值黏度和最终黏度均有降低,衰减值增大。

摘要：本研究根据类芽孢杆菌的普鲁兰酶基因的保守区设计兼并引物,从Paenibacillus puldeungensis LK18中扩增出普鲁兰酶基因(pulA),将其连接至pET-28a(+)载体上,构建出重组表达载体pET-28a(+)-pulA,转入到Escherichia coli BL21(DE3)中,成功地表达了重组普鲁兰酶。结果表明:该普鲁兰酶基因全长1968 bp,编码655个氨基酸。通过Ni柱亲和层析纯化出重组蛋白,测定其比酶活为508.8 U/mg,分子量约为76.95 ku。该重组酶的最适反应温度为45℃,在35℃~40℃下保温120 min后剩余酶活达60%以上;最适作用pH为6.0,在pH 6.0~8.0条件具有较好的稳定性;10 mmol/L的K^+和Mg^2+对该重组普鲁兰酶有激活作用,而Zn^2+、Mn^2+、Ni^2+、Fe^2+、Cu^2+、Co^2+、Ca^2+等对其有不同程度的抑制作用。本研究成功地构建出一株可高效表达普鲁兰酶的重组菌株,具备一定的工业应用价值。

摘要：根据NCBI上公布的普鲁兰酶基因的保守序列设计简并引物,以Thermococcus siculi HJ21基因组DNA为模板进行PCR,得到*** HJ21普鲁兰酶的基因,测序后通过Blast(NCBI)数据库比对和分析表明扩增基因有一个4056bp、编码1351个氨基酸的开放阅读框,为一新的普鲁兰酶基因。将该基因插入表达载体pET28a,并转化Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导,测定普鲁兰酶比活力。重组转化子的细胞破碎液有高温普鲁兰酶活性,SDS-PAGE电泳结果显示出分子质量约为150kD的特异性条带。

摘要：克隆嗜热枯草芽孢杆菌WY-34普鲁兰酶基因并在大肠杆菌中进行表达,对重组酶进行纯化和酶学性质研究,根据枯草芽孢杆菌的普鲁兰酶蛋白序列,设计PCR引物对WY-34的普鲁兰酶基因进行克隆及异源表达。对表达蛋白的最适pH、pH稳定性及最适温度、温度稳定性等特性进行研究,并测定重组普鲁兰酶的底物特异性。将普鲁兰酶基因pluA克隆及分析序列后,发现基因长度为2.2 kb,编码718个氨基酸,在大肠杆菌中异源表达。通过Ni-IDA亲和层析一步纯化得到比活力为93.2 U/mg的纯酶,SDS-PAGE和凝胶层析测定的分子量分别为76.2 kD和74.3 kD。酶学性质研究表明,该酶的最适温度为40°C,在温度不高于45°C条件下稳定;最适pH为6.0,同一温度下pH 6.0-9.0范围内处理30 min可以保持80%以上的酶活力,此酶对普鲁兰糖有很强的底物特异性。此重组普鲁兰酶的酶学性质表明此酶具有一定的工业化应用价值。

摘要：采用响应面法对一株普鲁兰酶产生菌的产酶条件进行优化。首先,结合单因素实验,通过Plackett-Burmen试验设计,以P<0.05为准,筛选出玉米淀粉、玉米浆、初始p H对普鲁兰酶产量有显著影响。根据响应面分析得到普鲁兰酶酶活最佳工艺参数为:玉米淀粉浓度3.49%,玉米浆浓度2.48%,初始p H为6.7。最后,优化后的培养基成分如下:玉米淀粉浓度3.49%,葡萄糖0.4%,玉米浆浓度2.48%,Fe SO40.1%,K2HPO4 0.1%,Mg SO4·7H2O 0.1%,初始p H为6.7,培养温度37℃,初始接种量为6%,酶活达到11.633U/m L。

摘要：以海洋交替单胞菌(Alteromonas sp. Y-389)的基因组为模板,设计普鲁兰酶基因的引物并进行PCR扩增。将目的基因连接到载体pET-28a(+)后进行测序并进行生物信息学分析。结果显示,基因的开放阅读框全长4 347 bp,编码1 449个氨基酸的普鲁兰酶,为Ⅰ型普鲁兰酶,有4个保守的结构域,属于糖苷水解酶家族13;将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),成功诱导出了可溶性的目标蛋白;随后对其酶学性质进行测定与分析,结果表明,该酶的比活力为54.53 U/mg,其最适的反应温度为35℃,最适pH为6.0,Na^+和Mn^2+对该酶的活性具有明显的促进作用,而Cu^2+,Zn^2+与Fe^2+对其活性的抑制作用比较明显;其酶学参数Km和Vmax分别为3.12 mg/mL,228.8 U/mg,将为今后的规模化生产提供数据支持。

摘要：根据NCBI上报道的基因序列设计引物,以长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)ATCC53909的染色体DNA为模板,PCR扩增普鲁兰酶编码基因pulB。将此基因与表达载体pWB980连接构建重组质粒pWB-pulB,并转化枯草芽孢杆菌WB600。SDS-PAGE结果显示,在100 kD处有特异性条带,经测定重组转化子粗酶液酶活力达10.94 U/mL。酶学性质分析表明,其最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0,且在温度30-60℃及pH4.0-6.0范围内稳定,适合淀粉加工行业的应用。

摘要：文章解析普鲁兰酶国家标准中各参数对普鲁兰酶活性的影响,以便于更好地理解利用国标,更好地分析实验误差。选用普鲁兰酶、糖化酶及中温淀粉酶作为测试样品,设计四组试验,每组试验重复3次,分别从阿卡波糖、淀粉酶、底物、终止剂等参数来探讨对普鲁兰酶活性的影响。结果表明,阿卡波糖、淀粉酶、不同厂家底物和不同配置方法的DNS均对普鲁兰酶活性有影响。阿卡波糖是否添加对酶活性影响很大,该酶经过含阿卡波糖的缓冲液稀释后,需在最短时间内测试酶活性,时间放置越长,酶活性下降越快,关于阿卡波糖的作用机制还有待研究。糖化酶比中温淀粉酶对普鲁兰酶活性影响大。本文选用TCI公司的底物P0978检测的酶活性较高,但在允许的试验误差范围内。GB/T 23874—2009中DNS试剂检测的酶活性比国家标准中的DNS试剂酶活性高。

摘要：[目的]构建长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体枯草芽孢杆菌工程菌株,优化发酵条件,筛选廉价的培养基原料生产普鲁兰酶。[方法]利用分子生物学手段,将基因pul324和表达载体p WB980连接,构建表达质粒p WB-pul324并转化Bacillus subtilis WB600;对表达产物进行SDS-PAGE分析和初始酶活的测定。进一步优化发酵条件,对不同碳源和氮源进行发酵培养基的筛选,同时研究不同金属离子的添加和培养基初始p H、接种量对发酵产酶的影响。[结果]获得基因工程菌*** WB600/p WB-pul324,SDS-PAGE电泳结果显示在89 k Da处有特异性条带,发酵初始酶活为12.34 U/ml;筛选得到玉米淀粉水解液和玉米浆干粉为培养基最适碳源和氮源,其最适浓度分别为50 g/L和30 g/L。Mn^(2+)、Fe^(3+)、Fe^(2+)和Tween-80的添加能提高发酵产酶活力。在最适初始p H 6.5,以最适5%接种量接种于优化后的培养基中,摇瓶发酵80 h普鲁兰酶的酶活达到414.48 U/ml。[结论]实现了普鲁兰酶突变体在枯草芽孢杆菌中的高效表达,筛选获得的培养基主要原料经济低廉,经过发酵条件优化后,重组菌酶活达到414.48 U/ml,是之前研究结果(20.16U/ml)的20倍。

摘要：大肠杆菌表达外源蛋白的过程中会受到各种外源和内源的胁迫并且形成了多种感受和响应特定刺激的胁迫信号传导系统。细菌胁迫应激时,许多小的非编码RNA(small non-coding RNA,sRNA)参与mRNA转录后调节,改变其翻译效率和稳定性,调节基因表达。通过过表达人工设计的micA反义sRNA anti-micA(bprO和omU)阻断micA对ompA的沉默,进而阻断sigma E介导的细胞自溶信号转导途径,提高大肠杆菌存活力和表达普鲁兰酶能力,并初步讨论了影响人工设计反式编码sRNA功能的影响因素。研究发现,在bprO和omU过表达菌株中,菌落形成单位分别提高了0.5和1个数量级,ompA mRNA相对水平分别提高了7.2和6.9倍,OmpA蛋白含量均显著提高,普鲁兰酶产量分别提高了1.4和1.8倍,并且omU的过表达比bprO的过表达对菌体特性的影响更大。为菌种改良提供了一种新的方法,并为反式编码sRNA的设计提供参考性指导。