摘要：李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)严重危害蔷薇科植物,在世界范围内普遍分布。为建立快速有效的PNRSV检测方法,依据PNRSV CP基因序列设计引物,并从桃叶片上扩增PNRSV-CP片段,将双酶切产物插入原核表达载体pET28a中,获得重组质粒pET28a-CP^(PNRSV),转化大肠埃希菌Rosetta菌株,IPTG诱导重组蛋白表达。SDS-PAGE电泳检测显示,在分子量约25 ku处有蛋白质条带,符合预期大小。镍柱亲和纯化PNRSV CP蛋白,以其纯化蛋白质免疫健康新西兰白兔,制备多克隆抗血清。Western blot、ELISA、Dot blot检测结果显示,制备的抗血清能检测到PNRSV CP基因在感病植物叶片中表达,而在健康植株中未检测到;制备的抗血清滴度稀释至1∶64000时,仍能与纯化蛋白质发生特异性反应。综上,制备的PNRSV抗血清特异性强、效价高,可用于PNRSV的快速检测。

摘要：采用多重RT-PCR方法,建立可同时检测李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ring spot virus,简称PNRSV)、李矮缩病毒(Prune dwarf virus,简称PDV)、樱桃绿环斑驳病毒(Cherry green ring mottle virus,简称CGRMV)的方法。根据GenBank中PNRSV、PDV、CGRMV的保守基因序列设计特异性引物,并对多重RT-PCR的退火温度、循环数、灵敏度、特异性、dNTPs浓度等因素进行优化,建立能同时检测3种樱桃病毒的多重RT-PCR方法。该方法能同时扩增出PNRSV(675 bp)、CGRMV(363 bp)、PDV(304 bp)特异片段,扩增产物大小与预期相符。测序结果表明,3种病毒的序列与相应参考序列相似性达90%以上。多重RT-PCR反应条件优化结果显示,在退火温度为58℃、35个循环条件下,效果均较为理想;dNTP的浓度对试验结果影响不大,最适的浓度为0.6 mmol/L;灵敏度分析结果显示,最低检测浓度为59.7 ng/μL。应用该方法对新疆石河子地区的樱桃样本进行检测,结果显示,该方法可以准确、快速、灵敏地同时检测单一或复合侵染的3种樱桃病毒。