摘要：目的: 在本实验室已克隆得到的灭蚊真菌卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因的部分序列的基础上,继续分离该基因的全基因组序列。方法:采用构建卡地腐霉mini基因组文库的方法,首先利用已知序列设计引物,克隆得到该蛋白酶基因的部分基因组序列;然后采用限制性内切酶XhoⅠ消化卡地腐霉基因组DNA,同时用该内切酶消化质粒pBluescriptSK( -),经去磷酸化后,将基因组酶切产物克隆到载体上并转化到大肠杆菌JM109中,构建mini基因组文库。利用载体上的通用引物和根据已知序列设计的引物,进行嵌套式PCR。结果:获得一780bp的PCR产物,经克隆、测序和分析为卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因已知序列一端301bp未知序列。结论:这种方法操作简便,实验周期短,能够特异地扩增与已知位点相邻的基因组DNA。

摘要：目的:实现贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su)类枯草菌素蛋白酶(subtilisin-like protease,Pr1)基因在大肠杆菌中的活性表达,验证已获得的基因序列(YP1977)是否属于subtilisin-like protease基因家族成员。方法:(1)提取贵阳腐霉总RNA,以已获得的序列(YP1977)为模版设计引物,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增Pr1基因ORF片段;(2)构建含有Pr1基因ORF序列、绿色荧光蛋白基因ORF序列的重组质粒pTWIN1-Pr1-EGFP,转化表达菌株***2566,IPTG诱导菌株表达Pr1蛋白酶。结果:成功构建含有Pr1基因ORF序列、绿色荧光蛋白ORF序列的重组质粒pTWIN1-Pr1-EGFP,实现了Pr1基因在大肠杆菌中的活性表达。结论:证明已获得的DNA序列是贵阳腐霉的一个Pr1基因的编码区。